橄榄炭疽病生物防治潜力菌Phoma glomerata与Trichoderma atroviride对Colletotrichum属病原菌的拮抗作用研究

《Biological Control》：Phoma glomerata and Trichoderma atroviride as promising biocontrol agents against Colletotrichum species causing olive anthracnose

　　

专业翻译摘要 Phoma glomerata和Trichoderma atroviride作为针对引起橄榄炭疽病（olive anthracnose, OA）的Colletotrichum属物种的有前景的生物防治剂 本研究评估了六种生物防治剂（biological control agents, BCAs）对来自意大利和西班牙的16株Colletotrichum分离株（属于6个物种）的拮抗活性，采用体外双重培养和挥发性有机化合物（volatile organic compounds, VOCs）介导的抑制试验。随后，在离体橄榄果实和活体植株试验中，进一步评估了这些BCAs对最具致病力的Colletotrichum分离株的预防效果。在体外试验中，所有BCAs均显著抑制了Colletotrichum的菌丝生长（P < 0.05），其中Trichoderma spp.表现出最强的整体拮抗作用，这主要归因于其产生的VOCs。在离体果实试验中，处理效果因试验批次而异。在第一轮试验中，仅铜制剂和Bacillus subtilis QST 713显著降低了由C. nymphaeae Col-151引起的病情；而在第二轮试验中，Phoma glomerata PV-375、Trichoderma atroviride TS和铜制剂均有效减少了由C. acutatum C9D2C引起的病害。对于C. godetiae Col-511和OLP12，仅铜制剂在两个试验中均表现出一致的防效。在活体植株试验中，P. glomerata PV-375和T. atroviride TS分别将C. acutatum C9D2C引起的发病曲线下相对面积（relative area under the incidence progress curve, RAUIPC）降低了88%和82%，而T. atroviride TS和B. velezensis PV-700则使C. godetiae Col-511的RAUIPC分别降低了86%和77%。这些发现表明，P. glomerata PV-375和T. atroviride TS是用于管理橄榄炭疽病的最有潜力的BCAs，但其防效依赖于病原菌种类和试验体系。

论文解读文章

研究背景与科学问题

橄榄（Olea europaea L.）是地中海盆地最具经济和标志性意义的果树作物之一。近二十年来，橄榄种植从传统的低密度雨养果园向集约化和超高密度生产系统转变，虽然大幅提高了产量，但也导致树冠密闭、通风不良和果叶湿润期延长，为喜湿性病害的流行创造了有利条件。橄榄炭疽病（olive anthracnose, OA）正是在这种背景下日益突出的病害，主要由Colletotrichum属的多种真菌引起，在秋季果实成熟期温暖潮湿的地中海地区（如西班牙南部、葡萄牙南部和意大利南部）危害尤为严重。该病害不仅造成果实减产和提前脱落，还严重劣化橄榄油的化学组成（包括酚类物质谱和酸度），降低感官品质，给种植者和加工商带来重大经济损失。

目前OA的防控主要依赖以铜制剂为主的化学杀菌剂的重复施用。然而，长期大量使用铜制剂引发了环境和健康担忧，并已导致病原菌种群结构变化和敏感性下降的菌株出现。与此同时，欧盟推动的农药可持续使用指令（Directive 2009/128/EC）和“从农场到餐桌”战略进一步强化了对开发传统化学杀菌剂有效且可持续替代方案的需求。在此背景下，生物防治剂（biological control agents, BCAs）——包括能够通过竞争、抗生作用、重寄生和/或诱导寄主抗性来抑制植物病原菌的有益微生物——成为OA可持续治理的有前景工具。尽管已有一些关于BCAs防治OA的研究，但不同BCAs对多个Colletotrichum物种和分离株的比较性防效信息仍然有限，尤其是将体外筛选与离体果实和活体植株试验相结合的系统性评估更为匮乏。

因此，本研究旨在评估隶属于Aureobasidium、Bacillus、Epicoccum、Phoma和Trichoderma属的六种候选BCAs对来自意大利和西班牙的16株Colletotrichum分离株（涵盖6个物种）的拮抗活性，并通过体外、离体和活体三个层次的试验，为后续田间验证筛选最有潜力的BCAs提供依据。

主要技术方法

研究人员采用了多层次的实验体系。首先，通过体外双重培养法（dual culture assay）和对扣培养法（测定挥发性有机化合物VOCs介导的抑制作用），评估了六种BCAs对16株Colletotrichum分离株菌丝生长的抑制率。其次，在离体橄榄果实上，选取8株代表性Colletotrichum分离株进行致病力测定，再从中选出4株最具致病力的分离株，评估BCAs预处理（两次喷雾，分别在接种前96小时和24小时）对病情发展的预防效果，并以铜制剂（copper sulphate）和商品化Bacillus subtilis QST 713（Serenade? ASO）作为对照产品。最后，在可控环境条件下，将离体果实试验中效果最佳的BCAs应用于带有附着果实的盆栽橄榄植株（cv. Arbequina），评估其对C. acutatum C9D2C和C. godetiae Col-511的防治效果。所有试验均采用完全随机区组设计并重复两次，通过方差分析（ANOVA）和Fisher保护最小显著性差异（LSD）检验进行统计分析，必要时使用非参数Kruskal-Wallis检验。

研究结果

4.1 BCAs对Colletotrichum spp.菌丝生长的影响

总体而言，所有BCAs在两种体外试验中均能减少Colletotrichum spp.的菌丝生长，但抑制程度因BCA种类、Colletotrichum物种和试验方法而异。在双重培养试验中，Aureobasidium pullulans PV-1033和两种Trichoderma物种（T. asperellum IMI393899和T. atroviride TS）通常是最有效的拮抗菌，而Phoma glomerata PV-375和Epicoccum nigrum RD4C的抑制活性较低。在VOCs试验中，两种Trichoderma物种对大多数病原菌分离株表现出比其他BCAs更高的抑制活性。

4.1.1 对C. acutatum的效果

在双重培养中，T. atroviride TS对UWS149抑制率最高（63.1%），A. pullulans PV-1033对C9D2C抑制最强（61.1%），两者对Col-256的抑制也最高（约58%）。在VOCs试验中，两种Trichoderma显著优于其他BCAs，T. atroviride TS对UWS149和Col-256的抑制率达79.8%和76.9%，T. asperellum IMI393899对C9D2C的抑制率为67.2%。

4.1.2 对C. fioriniae的效果

在双重培养中，A. pullulans PV-1033和T. atroviride TS最有效（抑制率分别为59.3%和56.6%），P. glomerata PV-375最低（34.6%）。在VOCs试验中，T. asperellum IMI393899和T. atroviride TS分别抑制79.1%和78.2%，其余BCAs低于30%。

4.1.3 对C. gloeosporioides的效果

在双重培养中，A. pullulans PV-1033对AC24抑制率最高（60.4%），对RD9B也最高（63.5%）。在VOCs试验中，T. asperellum IMI393899对AC24和RD9B的抑制率分别为55.8%和58.1%，T. atroviride TS分别为42.7%和45.6%。

4.1.4 对C. godetiae的效果

在双重培养中，两种Trichoderma对OLP12和OLP16的抑制率均超过60%，A. pullulans PV-1033对Col-505、Col-511和Col-514也表现强活性。在VOCs试验中，T. atroviride TS对OLP12、Col-505和Col-514抑制率最高（分别为80.1%、78.4%和75.9%），T. asperellum IMI393899对OLP16、Col-508和Col-511抑制率最高（分别为76.8%、79.8%和83.1%）。

4.1.5 对C. karsti的效果

在双重培养中，A. pullulans PV-1033对CAM和C12D1A抑制率最高（分别为66.6%和68.0%）。在VOCs试验中，抑制水平普遍较低，T. atroviride TS对CAM（29.7%）和C12D1A（32.0%）抑制率最高。

4.1.6 对C. nymphaeae的效果

在双重培养中，A. pullulans PV-1033和T. atroviride TS对Col-151抑制最强（约58%），T. atroviride TS和T. asperellum IMI393899对Col-466抑制最强（64.8%和63.8%）。在VOCs试验中，T. atroviride TS对Col-151和Col-466的抑制率高达74.7%和86.8%。

4.2 Colletotrichum分离株在离体橄榄果实上的致病力

所有8株分离株均能在离体橄榄果实上引起典型炭疽病症状，但致病力差异显著（P ≤ 0.0001）。C. godetiae Col-511和Col-508以及C. nymphaeae Col-151致病力最强，RAUDPC值分别为86.7%、84.5%和76.2%，病情严重度（DS）均超过80%，发病率（DI）均高于88%。两个C. acutatum分离株（UWS149和C9D2C）致病力中等，RAUDPC约42%-43%。C. godetiae OLP12和OLP16以及C. nymphaeae Col-466致病力最弱。

4.3 BCAs在离体橄榄果实上对病情发展的影响

由于两轮试验间存在显著差异，数据分别分析。在第一轮试验中，仅对C. nymphaeae Col-151，铜制剂和B. subtilis QST 713显著降低了RAUDPC、RDS和DI，而所有BCAs均未达到统计学显著水平的防效。在第二轮试验中，对C. acutatum C9D2C，P. glomerata PV-375和铜制剂显著降低了所有病情指标，T. atroviride TS也显著降低了RDS和DI；对C. godetiae Col-511，仅铜制剂显著降低了所有指标；对C. godetiae OLP12，铜制剂和T. atroviride TS显著降低了所有指标。

4.4 选定BCAs在活体植株上的效果

基于离体果实试验结果，选择P. glomerata PV-375和T. atroviride TS进行活体植株试验。对C. acutatum C9D2C，P. glomerata PV-375和T. atroviride TS分别将RAUIPC降低了88%和82%，效果与铜制剂（94%）相当，且均显著优于B. subtilis QST 713。对C. godetiae Col-511，T. atroviride TS和B. velezensis PV-700分别将RAUIPC降低了86%和77%，同样与铜制剂（94%）无显著差异，且显著优于B. subtilis QST 713。

讨论与结论

本研究的创新之处在于首次在同一框架内比较了六种不同属的BCAs对多种Colletotrichum物种的拮抗活性，并跨越了从体外到离体再到活体植株的三个层次验证。研究表明，BCAs的防效高度依赖于病原菌种类、分离株以及试验体系。体外试验中表现优异的Trichoderma spp.（主要通过VOCs机制）在离体果实试验中未能稳定重现其高效性，而体外表现中等的P. glomerata PV-375却在活体植株试验中对C. acutatum展现出卓越防效，凸显了多层次筛选的必要性。

研究结论指出：P. glomerata PV-375和T. atroviride TS是管理橄榄炭疽病最有潜力的生物防治候选菌株，其防效依赖于病原菌种类和试验体系。这一发现为后续在田间条件下进一步验证这两种BCAs的有效性提供了坚实的科学基础，也为开发基于这些有益微生物的商业化生物防治产品指明了方向。