非基因组雌激素样信号激活剂（ANGELS）的筛选及其在阿尔茨海默病中的神经保护潜力

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Selection of novel activators of non-genomic estrogen-like signaling (ANGELS) with promising potential for Alzheimer’s disease

　　

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是全球最常见的痴呆类型，影响超过5500万人。绝经后女性患AD的风险是同年龄段男性或年轻个体的2到3倍，这种性别差异主要由性激素17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）的减少所驱动。E2对基底前脑胆碱能神经元（basal forebrain cholinergic neurons，BFC）具有显著的保护作用，并能改善认知功能、突触可塑性和线粒体功能。然而，长期使用E2进行激素替代疗法（hormone replacement therapy，HRT）会带来严重的副作用，如血栓、中风、乳腺癌和子宫内膜癌风险增加。E2的传统作用主要通过核雌激素受体α和β（estrogen receptor α/β，ERα/ERβ）介导的慢速转录效应（即经典基因组途径）实现，而近年来的研究表明，E2也能通过膜受体等快速激活胞内信号通路（即非基因组或非经典途径），发挥神经保护、血管保护和抗骨质疏松等积极作用，且不直接调控基因转录。选择性激活非经典E2通路可能避免雌激素样副作用，开辟新的治疗可能性。基于此，研究人员通过计算机虚拟筛选、体外和体内实验，鉴定了一类新型的非基因组雌激素样信号激活剂（Activators of Non-Genomic Estrogen-Like Signaling，ANGELS）。其中，候选分子A3270（ethiocholane-3,17-dione，又称5β-androstane-3,17-dione）能够绕过经典基因组途径，激活非经典信号通路，并在神经毒性AD动物模型和转基因AD小鼠模型中有效挽救胆碱能纤维的丢失，表现出良好的神经保护潜力，且未引起子宫增重等雌激素样副作用。这些发现表明，ANGELS类化合物可能为AD的治疗提供更安全的新策略。

研究背景与问题

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是最常见的痴呆类型，全球患者超过5500万。AD中基底前脑胆碱能神经元（basal forebrain cholinergic neurons，BFC）及其向皮层和海马的投射受到显著损害，导致认知缺陷、思维改变和记忆丧失。流行病学数据显示，绝经后女性患AD的风险是同龄男性的2到3倍，这一性别差异很大程度上归因于性激素17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）的变化。E2已知能调节胆碱能神经元功能，并对无名质/基底大细胞核复合体（substantia innominata/nucleus basalis magnocellularis，SI/NBM）具有保护作用，同时促进突触可塑性、树突形成和脑线粒体功能。然而，长期使用E2进行激素替代疗法（hormone replacement therapy，HRT）会带来严重副作用，包括血栓、中风、乳腺癌和子宫内膜癌风险增加。现有文献关于长期HRT对AD和认知功能的影响存在显著争议，大规模研究常因干预时机不同而得出矛盾结果。

传统上，E2的细胞效应被认为主要通过核雌激素受体α和β（ERα，ERβ）介导的慢速转录作用（经典基因组效应）实现。但近年研究明确，E2也能通过改变胞质信号转导通路（称为非基因组或非经典作用）产生快速效应。非经典机制可通过直接作用于膜雌激素受体或间接作用于G蛋白偶联雌激素受体（GPER1）实现，进而激活胞内第二信使如环磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶B（AKT）、细胞外调节激酶1/2（ERK1/2）、钙调蛋白激酶（CaMK）或丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等。有证据表明，雌激素受体存在两个不同的结合位点——经典结合位点（classical binding site，CBS）和替代结合位点（alternative binding site，ABS），激活ABS可触发非经典信号机制。越来越多的证据显示，E2对血管疾病、神经保护和骨质疏松的积极效应可归因于非经典信号通路。

选择性激活非经典E2通路可能预防雌激素样副作用并开辟新的治疗可能性。该领域进展已鉴定出新型分子群，包括非基因组雌激素样信号激活剂（Activators of Non-Genomic Estrogen-Like Signaling，ANGELS）。本研究旨在发现兼具雌激素样保护效应但避免经典副作用的新型ANGELS分子。

研究方法概述

研究人员采用从计算机模拟筛选到体内神经保护和行为测试的系统性实验流程。首先，对来自Steraloids数据库的2519种合成和内源性甾体分子进行计算机虚拟筛选，针对人ERα的经典结合位点和替代结合位点进行分子对接计算。随后，利用MCF7人乳腺癌腺癌细胞系（内源表达三种雌激素受体ERα、ERβ和GPER1）进行体外雌激素反应元件（estrogen responsive element，ERE）活性检测和Western blot蛋白磷酸化分析。体内实验中，使用C57BL/6J小鼠和3xTg-AD转基因AD小鼠（携带PSEN1、APP_Swe和tauP301L三个人类AD相关基因突变），通过卵巢切除术（ovariectomy，OVX）建立激素剥夺模型，采用Aβ_1-42脑内立体定位注射建立神经毒性AD模型，并通过急性皮下给药评估候选分子的神经保护效果、子宫增重副作用和行为学效应。

研究结果

1. 候选分子的计算机虚拟筛选

通过分子对接计算，研究人员根据效率指数/分子量值筛选出15个候选分子用于后续体外/体内实验。

2. 体外ERE活性检测

在MCF7细胞中进行的荧光素酶报告基因实验显示，与溶剂对照组相比，E2处理显著增加了ERE活性。A3270、A3613、C0700、A1834、A0660和P8090这6个分子与溶剂组无显著差异，表明它们不刺激ERE活性，可能不具有经典副作用。其他9个分子显著增加ERE活性，因此被排除出后续实验。

3. 体内子宫增重副作用检测

在去势雌性C57BL/6J小鼠中，单次皮下注射高剂量E2（330 ng/g）24小时后诱导了显著的子宫增重效应。而A3270、A0660、A3613、A1834、C0700和P8090均未产生类似效应。上皮层厚度测量显示，仅E2处理组显著增厚。体外ERE活性与体内子宫重量之间存在显著正相关性，证实了经典途径激活与副作用之间的密切关联。

4. 体外非经典作用机制表征

Western blot实验确定E2处理5分钟为最佳时间点，此时AKT和ERK1/2磷酸化水平显著升高。所有6个ANGELS分子（A3270、A3613、C0700、A1834、A0660、P8090）均在5分钟内显著诱导AKT和ERK1/2的磷酸化。值得注意的是，仅A3270显著增加了CREB的磷酸化水平。竞争性结合实验表明，A3270能够像E2一样从细胞质和细胞核受体中置换荧光标记的E2，证明其能与雌激素受体结合，但可能通过替代结合位点发挥作用。

5. 神经毒性AD模型中的神经保护作用

选择A3270作为最具潜力的候选分子进行进一步研究。将Aβ_1-42单侧注射入小鼠SI/NBM复合体后，同侧体感皮层出现约20%-25%的胆碱能纤维丢失。在神经毒素注射后1小时给予单次皮下E2或A3270（33 ng/g），两者均能有效将纤维丢失降低至约10%，且效应无性别差异。两种处理均未影响SI/NBM区胆碱乙酰转移酶阳性神经元数量的变化。

6. 转基因AD模型中的行为和形态学效应

在去势的6月龄雌性3xTg-AD小鼠中，Y迷宫测试显示各组短期记忆均正常（正确交替率高于50%），但A3270处理显著增加了进入臂的次数，提示其改善了转基因小鼠中常见的运动功能减退。强迫游泳测试中，E2处理显著增加了挣扎行为（主动逃避反应），而A3270则表现出与E2相反的效应模式，提示其可能具有更优的抗焦虑特征。形态学方面，单次E2或A3270处理后48小时，两者均显著增加了体感皮层的胆碱能纤维密度，但对SI/NBM区的胆碱能神经元数量无影响。对Aβ斑块和磷酸化Tau缠结的定量分析显示，急性处理48小时内未观察到显著变化。子宫重量检测再次确认A3270不具有雌激素样子宫增重副作用，且两种处理对免疫相关组织（脾脏、胸腺）和肾上腺重量均无影响。

讨论与结论

通过系统的计算机模拟、体外和体内验证实验，研究人员成功鉴定出6个新型ANGELS化合物，其中A3270（etiocholanedione，又名5β-androstane-3,17-dione）作为最具前景的候选分子进行了深入评估。A3270是一种雄激素（如睾酮、二氢睾酮、脱氢表雄酮和雄烯二酮）的内源性代谢产物，与脱氢表雄酮不同，它无法进一步代谢为雄激素或雌激素，这可能解释了其缺乏ERE活性和子宫增重效应的原因。A3270对雌激素受体替代结合位点的亲和力可能是其快速激酶活化的基础。

在神经毒性AD模型中，A3270展现出与E2相似的神经保护效果，能够有效挽救Aβ_1-42诱导的胆碱能纤维丢失，且效应无性别差异。在3xTg-AD转基因模型中，单次A3270处理同样增加了胆碱能纤维密度，并改善了运动功能。重要的是，A3270不激活ERE转录活性，不引起子宫增重，且在强迫游泳测试中表现出不同于E2的行为谱，提示其可能具有更优的安全性特征。这些发现表明，选择性激活非经典雌激素信号通路的ANGELS类化合物可能为AD治疗提供一种更安全的新策略，同时强调了性别差异在疾病进展和治疗反应中的重要性。