肉桂基哌嗪衍生物作为抗生素增效剂的开发：基于骨架跃迁策略的新型外排泵抑制剂研究

《Bioorganic Chemistry》：Development of cinnamyl derivatives as antibiotic-potentiating agents

　　

摘要专业翻译 抗菌药物耐药性（AMR）对现代医学构成重大威胁。耐药结节化细胞分裂（RND）超家族外排泵（EP）在革兰阴性菌多药耐药中发挥主导作用，其中以大肠杆菌（E. coli）中的AcrAB-TolC系统最具代表性。外排泵抑制剂（EPI）与抗生素（ATB）联合给药是恢复抗生素活性、克服耐药性的有前景策略。本研究采用骨架跃迁策略，以已知EPI——1-(1-萘甲基)哌嗪（NMP）为先导，通过开环设计开发了1-肉桂基哌嗪骨架，合成并系统评估了一系列衍生物。其中，化合物27（含4-三氟甲基取代）表现出最广谱的抗生素增效活性，在七种测试抗生素中对五种呈现浓度依赖性协同增效，其广谱性优于结构相关的参考抑制剂NMP。机制研究表明，利奈唑胺（LNZ）增效作用与AcrAB-TolC外排系统抑制相关，而红霉素（ERY）增效还涉及额外的膜通透化机制。Hoechst 33342积累实验和碘化丙啶（PI）膜通透化实验证实，化合物27和4兼具外排抑制与膜通透化双重活性。此外，化合物27在成熟大肠杆菌生物膜模型中显著增强ERY和LNZ的清除活性（最低生物膜清除浓度，MBEC），优于参考化合物PAβN。尽管部分高活性衍生物表现出一定细胞毒性（HepG2 IC50值较低），本研究仍支持1-肉桂基哌嗪作为有前景的抗生素佐剂骨架，为对抗耐药革兰阴性菌感染提供了新的化学空间和优化方向。

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一、研究背景与意义

抗菌药物耐药性（AMR）已成为全球公共卫生领域的重大威胁。根据最新全球疾病负担研究分析，2021年细菌性AMR与全球471万例死亡相关，其中114万例直接归因于AMR；预计到2050年，AMR相关死亡将增加69.9%。聚焦革兰阴性菌感染，2022年至2050年间新型有效疗法的开发有望挽救多达1110万人的生命。然而，新抗生素（ATB）研发管线持续缓慢，真正具有新化学类型或新作用机制的创新药物寥寥无几，临床不得不依赖老药和补救性治疗方案应对耐药菌感染。

细菌耐药机制多样，包括酶促药物失活、靶点修饰、通透性降低、药物隔离以及外排泵（EP）主动外排等。其中，外排泵过表达被视为产生多药耐药最快速、最有效的途径之一。在革兰阴性菌中，耐药结节化细胞分裂（RND）超家族外排泵主导多药耐药，其典型代表为大肠杆菌（E. coli）中的AcrAB-TolC三组分系统——由内膜转运蛋白AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道TolC组成，依赖质子动力驱动底物跨膜外排。大量多药耐药临床分离株中均观察到该泵编码基因的过表达。

外排泵抑制剂（EPI）与抗生素联合给药是恢复抗生素活性的有前景策略。早期报道的RND型EPI包括苯丙氨酸-精氨酸β-萘胺（PAβN）和1-(1-萘甲基)哌嗪（NMP），此外还有D13-9001、MBX2319、MBX3135和BDM91531等结构多样的化合物。然而，至今尚无EPI进入临床应用，安全性问题和体内效力不足限制了部分候选物的开发。因此，开发兼具疗效和可接受安全性的EPI仍是重要挑战。

二、研究内容与主要结论

研究人员针对上述问题，基于已知EPI NMP的结构，采用二级骨架跃迁策略（具体为开环设计），开发了1-肉桂基哌嗪这一化学上截然不同的抗生素增效骨架。通过系统的结构优化和生物学评估，合成了25个新衍生物，其中16个显著增效利奈唑胺（LNZ）活性，8个同时增强红霉素（ERY）效力。化合物27（4-三氟甲基取代）表现出最广谱的增效谱，与七种测试抗生素中的五种呈现协同作用（FICI ≤ 0.5），优于参考EPI NMP。机制研究揭示，LNZ增效主要源于AcrAB-TolC外排系统抑制，而ERY增效还涉及膜通透化等额外机制。化合物27在成熟大肠杆菌生物膜模型中显著增强ERY和LNZ的清除活性，优于PAβN。该研究为1-肉桂基哌嗪作为抗生素佐剂骨架的进一步优化提供了实验依据。

三、关键技术方法

研究人员采用了多种有机合成策略制备目标化合物：还原胺化（General Procedure 1）用于合成化合物1–9；三步合成路线（General Procedure 2和3）包括二异丁基氢化铝（DIBAL-H）还原肉桂酸为肉桂醇、三溴化磷溴化得到烷基化试剂10–20、再与过量哌嗪反应得到衍生物21–31；钯催化氰化反应制备腈类衍生物32；酰胺偶联（HATU/DIPEA，General Procedure 4）合成化合物34–36。生物学评估方法包括：微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和协同分数浓度指数（FICI）；HepG2细胞活力实验评估细胞毒性（IC₅₀）；棋盘法评估浓度依赖性增效；Hoechst 33342积累实验评估外排抑制；碘化丙啶（PI）/Syto 9双染实验评估膜通透化；最低生物膜清除浓度（MBEC）和最低生物膜抑制浓度（MBIC）实验评估生物膜活性。菌株包括大肠杆菌野生型（WT, BW25113）及ΔacrAB和ΔTolC敲除突变株。

四、研究结果

2.1 抗生素增效骨架的鉴定。 研究人员利用内部化合物库进行表型筛选，以LNZ对大肠杆菌临床株的增效活性为指标，发现取代和未取代的1-(2-萘甲基)哌嗪（2-NMP）为最强效命中化合物。鉴于NMP化学空间已被广泛探索，研究人员采用二级骨架跃迁策略（开环设计），鉴定出1-肉桂基哌嗪作为化学上截然不同的增效骨架，保留抗生素增效活性并作为后续优化基础。

2.2 1-肉桂基哌嗪抗生素增效剂的制备。 通过还原胺化、烷基化和酰胺偶联等多种互补合成策略，高效制备了结构多样的衍生物系列。所有终产物经HPLC-HRMS、¹H和¹³C NMR充分表征，纯度均≥95%。部分化合物（1、2、3、5、6、22、23、24、34）为已知或市售化合物，其在本研究中的价值在于提供SAR分析参考点。

2.3 抗菌活性及ERY和LNZ增效作用。 大多数1-肉桂基哌嗪衍生物固有抗菌活性极低（MIC > 1000 μM），符合EPI设计预期；仅二氯衍生物29和30显示有限固有活性（MIC = 250 μM）。ERY增效方面，间溴取代化合物25最强（ERY MIC = 5.45 μM）；单卤代衍生物中溴代物活性最高，与溴的强吸电子性和可极化性一致；三氟甲基衍生物27因兼具强吸电子性和高亲脂性而活性突出。但二卤代衍生物（29、30、31）未能提供额外增效，提示存在最佳亲脂性窗口。LNZ增效方面，更多衍生物（4、6、9、23、25、27、33）显示活性，其中23和25最强（LNZ MIC分别降至113 μM和138 μM）。化合物33（缺乏共轭双键）仍保留增效活性，表明延长π共轭并非活性必需。

2.4 选定分子的安全性特征。 HepG2细胞活力实验显示，亲脂性与毒性总体呈正相关，卤代程度越高毒性越大。但2-氟（21）和3-氟（22）衍生物偏离此规律，仅显示极低细胞毒性。值得注意的是，多个最有效衍生物（如27，HepG2 IC₅₀ = 28 μM）同时表现出较高细胞毒性，提示活性与毒性平衡尚待优化。

2.5 抗生素增效谱。 七个最有效衍生物（3、4、5、6、9、25、27）对额外五种抗生素（novobiocin, NOV；fusidic acid, FUS；pyridomycin, PYR；clindamycin, CLI；chloramphenicol, CHL）的增效评估显示，化合物27增效谱最广（NOV、FUS、PYR和CLI），而参考EPI PAβN增效所有测试抗生素。NMP仅增效LNZ、ERY和CLI。部分组合将MIC降至接近临床相关血浆浓度水平，但增效所需佐剂浓度超过相应HepG2 IC₅₀，凸显安全性改善需求。

2.6 AcrAB-TolC突变株中的抗生素增效。 在ΔacrAB和ΔTolC敲除株中，所有测试化合物对LNZ的增效仅在WT株中有效，表明LNZ增效主要通过AcrAB-TolC抑制实现。而ERY在敲除株中仍被显著增效，提示除AcrAB-TolC外还存在其他转运蛋白抑制或膜通透化等替代机制。PAβN在敲除株中仍显著增效ERY，与其已知的膜通透化作用一致。

2.7 棋盘实验。 化合物27在125 μM浓度下分别使LNZ和ERY效力增强9倍和4倍；化合物4需250 μM达到相当水平。两者均优于NMP（125 μM时仅LNZ增强8倍，ERY无显著效果）。PAβN增效最强，但高浓度下可能存在继发膜不稳定效应。

2.8 Hoechst积累实验。 所有测试化合物（4、27、NMP、PAβN）均增加Hoechst 33342（H33342）胞内积累，WT株中效应更显著，支持AcrAB-TolC参与。但ΔacrAB株中染料积累增加不能完全归因于外排丧失，膜性质改变可能部分贡献。衍生物4和27促进H33342积累的能力优于NMP。

2.9 膜通透化。 PI摄取实验显示，所有测试化合物在WT株中显著增加PI摄取，表明增强膜通透性。ΔacrAB突变株未处理对照即显示较高PI摄取，反映膜结构改变。除化合物4外，ΔacrAB株未观察到进一步通透性增加。Syto 9荧光同步增加表明化合物诱导膜通透化而非膜破裂导致细胞死亡。化合物4通透化效应最强，NMP最弱。

2.10 细菌生物膜中的抗生素增效。 MBEC实验中，化合物27显著增强ERY和LNZ对成熟生物膜的清除活性（ERY MBEC降至1.4 μM，LNZ MBEC降至92 μM），优于PAβN（仅对ERY有效）。MBIC实验中，仅PAβN显著增强两种抗生素对生物膜形成的抑制。结果表明27更擅长增强成熟生物膜清除，而PAβN在抑制生物膜形成方面更优，可能反映两者对群体感应等调控通路的不同影响。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，1-肉桂基哌嗪衍生物的抗生素增效活性受亲脂性、取代基大小、电子效应和构象灵活性共同调控。卤素取代（尤其溴）与增效改善相关，三氟甲基引入与最广谱活性相关。LNZ增效明确依赖AcrAB-TolC外排系统抑制，ERY增效则涉及外排抑制与膜通透化双重机制。化合物27在成熟生物膜清除方面表现突出，但高活性衍生物伴随较高细胞毒性，限制其转化潜力。

研究结论翻译：抗菌药物耐药性的持续上升是一项长期全球挑战。除开发新抗生素外，有效抗生素增效分子的鉴定和开发是增强已知抗生素疗效、延长现有药物临床使用寿命的有前景策略。在25个新合成的1-肉桂基哌嗪衍生物中，16个显著增效LNZ活性，其中8个同时增强ERY效力。值得注意的是，化合物27表现出最广谱的增效谱，与七种测试抗生素中的五种呈现协同作用，优于结构相关的参考EPI NMP。对最活性类似物，LNZ增效被证明源于靶向AcrAB-TolC外排系统，通过敲除突变体和pyridomycin（该泵已知底物）敏感性增加得到证实。然而，即使在敲除突变体中ERY活性也显著增强，表明存在额外作用模式。与PAβN的先前发现一致，检测到膜通透性增加，可能促进抗生素进入细菌细胞。膜通透性最强效应见于PAβN和化合物27，后者也表现出最广谱的抗菌增效谱。从结构角度看，卤素取代基（尤其溴）的引入与增效效果改善相关，如衍生物25和4所示。此外，苯环4位引入三氟甲基（化合物27）与最广谱活性相关。在浮游培养之外，选定1-肉桂基哌嗪衍生物对LNZ和ERY活性的效果在大肠杆菌生物膜这一更复杂生物学模型中进一步评估，涵盖生物膜形成抑制和成熟生物膜清除两方面。这些实验中，化合物27对成熟生物膜中LNZ和ERY均表现出显著增效。相比之下，测试衍生物对生物膜形成无显著影响，该活性仅由参考化合物PAβN保留。总体而言，这些发现支持1-肉桂基哌嗪作为抗生素佐剂进一步优化的有前景骨架。然而，部分抗生素增效所需浓度相对较高，加上多个最活性衍生物（包括化合物27）观察到的细胞毒性，目前限制了其转化或体内潜力的结论。因此需要进一步结构优化以改善抗生素增效活性与细胞毒性之间的平衡，之后才能评估其潜在体内效用。此外，这些化合物可能增加膜通透性，贡献其整体增效效果。尽管精确作用模式尚未阐明，1-肉桂基哌嗪衍生物增强抗生素活性（包括生物膜清除实验）的已证实能力，为其作为针对耐药革兰阴性菌的抗生素佐剂骨架的进一步研究和优化提供了依据。