paraisariamide E/ternatin杂合环七肽的结构–活性关系：d-MePhe4替换为d-Pip4增强细胞毒性

《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Structure–activity relationships of hybrid paraisariamide/ternatin cyclic heptapeptides

　　

基于ternatin的关键子结构，设计并合成了paraisariamide E衍生物；鉴定出paraisariamide E生物活性所必需的残基；将paraisariamide E的d-MePhe⁴替换为d-哌啶酸（d-Pip）可增强其生物活性。

环状六肽和七肽天然产物是开发治疗剂的重要来源，其α构型、骨架N-甲基化和侧链官能团的组合可赋予独特结构与生物学性质。已有多种含独特环七肽骨架的天然产物被报道，如cordyheptapeptide A、talarolide A、talaromides A–C、mortiamides等。paraisariamides（1a–h）为来源于昆虫病原Paraisaria真菌的N-甲基化环七肽，可抑制蛋白合成；其中paraisariamides A–D（1a–d）含3个N-甲基氨基酸，细胞毒性弱或无，而paraisariamides E–H（1e–h）含4个N-甲基氨基酸，对HCT116结肠癌等癌细胞具强细胞毒性；这些环肽抑制蛋白生物合成的分泌途径，疑似真核翻译延伸因子1A（eukaryotic translation elongation factor 1A, eEF1A）分子靶标尚未报道。ternatin（2）为与paraisariamides具有相似大环基序和组成氨基酸的环七肽；其可抑制3T2-L1小鼠脂肪细胞甘油三酯积累，并在纳摩尔水平抑制脂肪生成，十倍浓度下具细胞毒性；ternatin及类似物可靶向eEF1A.GTP.氨酰-tRNA三元复合物抑制蛋白合成。SR-A3（3）亦结合eEF1A并抑制翻译延伸；ternatin-4（4）基于ternatin（2）与SR-A3（3）共同子结构设计，对HCT116细胞毒性显著高于ternatin（2）并同样结合eEF1A，其特征子结构包括(2S,4R)-dehydromethylleucine（dhML²）和/或d-Pip⁴。鉴于paraisariamides与ternatins的结构相似性，研究人员以paraisariamides中最强效的paraisariamide E（1e）为先导，结合ternatins关键结构元件开展结构–活性关系（structure–activity relationship, SAR）研究，以鉴定活性必需残基并开发更有效衍生物。

关键技术方法：研究人员采用Fmoc固相肽合成（solid-phase peptide synthesis, SPPS）制备线性前体，经EDCI–HOAt介导大环化获得环七肽，并以高效液相色谱纯化；以A549肺癌细胞系进行MTS法（MTS assay）生长抑制实验并计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC₅₀）；采用构象–旋转异构体集合采样工具（Conformer–Rotamer Ensemble Sampling Tool, CREST）进行气相构象采样，并对最低能量构象的骨架重原子进行均方根偏差（root mean square deviation, RMSD）分析。样本来源为A549细胞系，无临床队列。

2.1 paraisariamide E/ternatin杂合七肽的设计与生物活性
研究人员将1e的d-allo-Ile⁵替换为d-allo-Thr⁵合成肽5，MTS法显示其IC₅₀为58 nM，细胞增殖抑制活性约为1e的一半；CREST分析显示1e与5的最低能量构象相当，提示d-allo-Thr⁵的β-羟基未显著改变整体大环构象，而1e侧链β-乙基更有利于细胞活性。基于ternatin的SAR，研究人员将5的l-Leu²和d-MePhe⁴分别替换为l-Phe和d-Pip得到肽6，结果显示肽6在10 μM仍无活性；构象比较显示6呈U形弯曲拓扑，d-Pip⁴折向l-MeAla⁷，l-Phe²远离大环骨架平面，而5中l-Leu²与d-MePhe⁴、l-MeAla⁷位于同面；结合ternatin中l-Leu²替换为l-Ala导致活性丧失，提示ternatin与paraisariamides共享的l-Leu²可能不可或缺。仅将1e的d-MePhe⁴替换为d-Pip得到肽7a，其IC₅₀为7.0±1.8 nM，较1e（29±8 nM）约强4倍；其最低能量构象呈J形并与1e整体形状相同，且20个最低能量构象的平均成对RMSD最小，提示d-Pip六元环可稳定大环构象并重现ternatin-4（4）的有利靶标相互作用。环化中伴生的[l-Ile⁶]-6和[l-Ile⁶]-7a在10 μM均无细胞增殖抑制，提示d-allo-Ile⁶的2R构型对强活性重要。上述结果表明，1e中d-MePhe⁴和d-allo-Ile⁶局部子结构主要贡献生物活性，且Ile⁶的d-allo构型有利。

2.2 paraisariamide E中d-MePhe⁴的结构–活性关系
由于7a活性最强，研究人员进一步在1e的d-MePhe⁴位引入可能调节全局大环构象的氨基酸，设计并评价7b–h。合成中发现6和7a中位置2的Phe或Leu与MeAla³固相偶联效率低，且7的大环化失败并产生未鉴定副产物；因此研究人员改变大环化位点，从C端Leu²起始进行SPPS，裂解后大环化得到7a–h。A549细胞活性结果显示：7b（d-Pro⁴）在10 μM下弱活性，IC₅₀约为10,000 nM（10 μM下抑制73%），提示五元环结构不利；7c（d-Tic⁴）IC₅₀为390±130 nM，较1e低13倍，提示融合环结构可能改变d-MePhe⁴苯基排布或诱导不利大环构象；7d（d-Phe⁴）IC₅₀为48±10 nM，与1e相当，提示N-甲基并非必需；7e（l-MePhe⁴）IC₅₀为80±16 nM，约为1e的三分之一；7f（l-MeAla⁴）在10 μM下抑制52%，IC₅₀约为10,000 nM；7g（l-Pip⁴）和7h（l-Phe⁴）的IC₅₀均>10,000 nM。结果表明，位点4氨基酸构型影响细胞毒性，但引入具有利侧链结构的l-氨基酸可维持活性；d-MePhe⁴的α构型有利于大环构象，其苯基可提供疏水相互作用，而7a中具有适当构型的融合哌啶环可能稳定有利大环构象并增强细胞毒性。

讨论与结论翻译：SAR研究表明，1e中多个残基的α构型和侧链结构共同贡献其纳摩尔级细胞毒性；d-Pip⁴替换是有望优化活性的关键位点，构象预测亦支持7a具有最低平均成对RMSD。研究结论译文为：研究人员基于天然产物paraisariamide E（1e）并结合细胞毒性ternatins中的结构元件，开展了环七肽结构–活性关系研究；证明1e中多个残基的α构型和侧链结构贡献其纳摩尔级细胞毒性。特别是将1e的d-MePhe⁴替换为d-Pip得到的肽7a，表现出强效细胞增殖抑制，提示该位置修饰可能有利改变大环结构的整体构象；确实，在初步气相构象预测中肽7a具有最低平均成对RMSD。上述发现有助于开发强效paraisariamide衍生物作为治疗药物。