可注射Cu/Zn-BG@HPCH热敏水凝胶通过靶向清除致病性B细胞并重塑骨免疫微环境治疗类风湿关节炎

《Bioactive Materials》：Injectable bioactive glass hydrogels orchestrate metalloimmunotherapy by depleting pathogenic B cells and rescuing bone in rheumatoid arthritis

　　

可注射生物活性玻璃（BG）水凝胶通过清除致病性B细胞并挽救类风湿关节炎（RA）中的骨组织来协调金属免疫治疗。可注射Cu/Zn-BG水凝胶在RA中实现局部金属免疫治疗。单次关节内给药可缓解TNF-Tg小鼠的滑膜炎并保护骨组织。BG@HPCH（Cu/Zn掺杂生物活性玻璃@羟丙基甲壳素水凝胶）选择性清除致病性B细胞，同时保留间充质干细胞（MSC）活力。单细胞转录组学显示BG@HPCH抑制CD23/CD74信号并促进成骨。

RA是慢性自身免疫病，以持续性滑膜炎、进行性软骨降解和关节周围骨破坏为特征；现有疾病修饰抗风湿药（DMARDs）和靶向生物制剂可缓解全身症状并延缓进展，但很少诱导持续缓解或恢复关节骨稳态。RA骨免疫微环境异常，异位三级淋巴结构（TLS）维持自身抗体产生和局部免疫过度激活；B细胞是TLS的结构和功能核心，除分泌自身抗体外还释放促炎因子，并与T细胞、滤泡树突状细胞和巨噬细胞协同，促进破骨细胞生成并抑制成骨。系统性B细胞清除（如rituximab）虽具临床疗效，但可导致广泛免疫抑制和机会感染，且不能重建侵蚀骨结构。金属免疫治疗利用Cu/Zn等生物活性离子诱导高活化免疫细胞氧化应激和线粒体凋亡，BG可可控释放离子；但裸BG颗粒需反复高剂量关节内注射，存在突释毒性和机械损伤。为此，研究人员构建可注射热敏羟丙基甲壳素（HPCH）水凝胶包载Cu/Zn掺杂BG（BG@HPCH），以期局部持续释放Cu²⁺/Zn²⁺，选择性清除致病B细胞并促进成骨。该论文由Ziwei Yan、Yue Chen、Fanrui Zeng等完成，发表于《Bioactive Materials》。

方法概括：研究人员合成HPCH，将B3-Cu-Zn BG按3、5、10 mg掺入制备L/M/H-BG@HPCH，用扫描电镜/能谱、流变、热重、红外和降解实验表征；以Transwell间接共培养、活/死细胞染色（live/dead）、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、碱性磷酸酶（ALP）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及巨噬细胞极化实验评价B细胞、MSC与破骨/巨噬细胞效应；在2月龄雄性TNF-Tg小鼠单次关节内注射10 μL/剂，用微型CT（micro-CT）、H&E、Safranin O、TRAP、ALP、免疫荧光和流式细胞术评价；对踝关节行单细胞RNA测序（scRNA-seq；BD Rhapsody，DNBSEQ-T7）并用Seurat、CellChat、SCENIC等分析；公共数据集GSE55235、GSE200815、GSE246416、SDY998及RA与OA滑膜样本用于验证。

3.1 Bioinformatics profiling identifies B cells as primary drivers of synovial inflammation in RA：研究人员整合公共bulk RNA测序与scRNA-seq数据，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和单样本基因集富集分析（ssGSEA）发现与B细胞富集最相关的疾病模块，并在单细胞水平观察到RA患者B细胞亚群扩增及促炎程序上调，据此提出局部清除致病B细胞并促进骨再生的设计思路。
3.2 Fabrication, physicochemical, and rheological properties of spatiotemporally responsive BG@HPCH hydrogels：制备B3-Cu-Zn BG与HPCH复合水凝胶，扫描电镜/能谱显示BG颗粒均匀嵌入多孔网络，流变学显示剪切变稀和37 ℃附近快速溶胶-凝胶转变，热重、红外和降解实验证明BG掺入提高结构稳定性和离子负载。
3.3 BG@HPCH hydrogels exert selective B cell cytotoxicity while preserving the osteogenic niche：Transwell间接共培养、live/dead和CCK-8显示BG@HPCH以浓度和时间依赖方式降低B细胞活力，而MSC活力保持；共培养中M-BG@HPCH提高MSC的ALP活性，并抑制核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的TRAP⁺破骨细胞形成且不降低前体活力，提示选择性B细胞毒性与成骨/抗破骨双重作用。
3.4 Local delivery of BG@HPCH relieves joint inflammation and prevents bone erosion in TNF-tg mice：在2月龄TNF-Tg小鼠单次关节内注射M-BG@HPCH，4周后关节炎指数下降，micro-CT显示骨侵蚀减少和骨体积分数（BV/TV）升高，H&E/Safranin O显示炎症浸润降低和软骨厚度保留，TRAP减少、ALP增加，流式显示B220⁺CD45.2⁺ B细胞减少而CD45.2^-Sca1⁺CD105⁺ MSC增加。
3.5 scRNA-seq reveals reprogramming of the osteoimmune microenvironment by BG@HPCH：对HPCH与BG@HPCH处理的踝关节细胞进行scRNA-seq，23,921个高质量细胞聚为23个簇；优势比（OR）和比例分析显示BG@HPCH减少B细胞、炎性巨噬细胞和致病成纤维细胞亚群，扩增成骨细胞、修复性巨噬细胞、保护性成纤维细胞和周细胞；差异表达和基因本体（GO）显示促炎基因下调、成骨相关基因和金属离子响应/内质网应激通路富集。
3.6 BG@HPCH redirects osteoblast differentiation while restricting B cell accumulation：对成骨细胞亚群进行CytoTRACE和Monocle拟时序分析，发现“Success”“Fail”“Pre”分支；BG@HPCH处理使成骨细胞主要进入“Success”轨迹，上调Twist1、Bmp2并下调Tnf、Il1b，SCENIC提示Msx1调控子；免疫荧光显示骨钙素（OCN）⁺成骨细胞增加、B220⁺ B细胞减少。
3.7 BG@HPCH dismantles pathological B cell crosstalk and dampens CD23/CD74 signaling axes：B细胞亚群分析显示BG@HPCH降低活化B细胞比例并增加初始B细胞（na?ve B cells），京都基因与基因组百科全书（KEGG）显示线粒体自噬/自噬上调、Th17分化信号下调；高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）和细胞通讯分析（CellChat）显示B细胞输出信号减少，CD23介导的输出信号近乎消失、CD74介导的输入信号降低；小鼠和人类RA滑膜免疫荧光显示CD23/CD74与B细胞标志物共表达，而OA对照中不明显。

讨论部分总结：讨论指出，病理B细胞是RA免疫失调和骨破坏的关键，BG@HPCH通过局部金属离子释放协同免疫调节与成骨；与前期裸Cu/Zn-BG颗粒研究相比，水凝胶改善局部离子递送和释放，Cu支持血管生成和抗炎，Zn促进成骨细胞成熟并抑制破骨，硼增强基质矿化，但多离子协同效应不能归因于单一离子。GO显示“对金属离子响应”通路激活；BG@HPCH降低B细胞CD23输出和CD74输入信号，减少异常抗原呈递和促炎因子释放；不同于靶向巨噬细胞/T细胞的策略，该研究聚焦B细胞，且BG@HPCH选择性减少活化B细胞、相对保留na?ve B细胞。RA为多因素疾病，单细胞和体内分析显示BG@HPCH还减少炎性巨噬细胞、TRAP⁺破骨细胞和致病成纤维细胞，扩增成骨相关再生群体，并伴随巨噬细胞M1标志物Nos2、Il12下调和M2标志物Tgfb1、Cd163、Mrc1保留或轻度升高。转化上，局部可注射离子释放避免全身免疫抑制并促进成骨，适用于RA、牙周炎等骨免疫疾病。局限包括未解析各离子单独贡献、单细胞通讯推断需功能验证、TNF-Tg模型外推性有限、长期关节内滞留/释放动力学和重复给药安全需研究。

研究结论翻译：总之，研究人员已确立过度活化B细胞是RA滑膜炎和骨免疫失调的中心架构者。为实现特异性治疗干预，研究人员工程化了一种可注射、时空响应性金属免疫治疗平台BG@HPCH，该平台将治疗离子的持续局部释放与结构性热敏水凝胶基质协同起来。这种双作用复合物有效且选择性地诱导致病B细胞凋亡，同时促进MSC成骨。在体内，该作用转化为TNF-Tg小鼠的显著疾病减轻、骨侵蚀预防和稳健关节保护。单细胞转录组分析揭示，BG@HPCH通过减少病理B细胞串扰（如中和CD23/CD74信号轴）并重定向基质和髓系群体向再生表型，全面重构不良关节微环境。通过桥接靶向免疫调节与主动骨再生，BG@HPCH成为RA及更广泛炎症性骨免疫疾病临床管理的高度可转化生物材料策略。