异质结纳米酶通过类铜死亡与类铁死亡协同实现高效抗菌

《Bioactive Materials》：Heterojunction nanozyme achieve highly efficient antibacterial by cuproptosis-like death and ferroptosis-like death

　　

摘要专业翻译 细菌感染长期对全球人类健康构成重大公共卫生威胁。尽管抗生素曾显著降低死亡率，但耐药菌的传播对传统疗法提出了严峻挑战。尤其在慢性感染或生物膜相关感染中，单一药物治疗易出现疗效降低，限制了其临床应用。近年来，程序性细胞死亡（PCD）在抗感染领域的作用逐渐受到关注。大量研究报道，除细胞凋亡外，多种形式的PCD（如焦亡、坏死性凋亡和铁死亡）已被应用于抗菌治疗。然而，由于病原体在进化过程中可获得抑制或逃避多种细胞死亡通路的能力，依赖单一PCD通路的激活策略往往不足以彻底清除病原体。此外，不同细菌感染所激活或易感的PCD类型各异，使得单一调控策略缺乏广泛适用性。因此，深入分析不同PCD在细菌感染中的调控机制，开发利用PCD实现高效抗菌活性的策略，对于增强抗感染疗效、克服细菌耐药性和免疫逃逸至关重要。 本研究成功开发了一种Cu2O/Fe2O3异质结纳米酶，并提出了一种协同诱导类铁死亡和具有类铜死亡特征的铜介导代谢毒性的抗菌策略，从而靶向并抑制细菌能量代谢通路。密度泛函理论（DFT）计算揭示，Cu2O/Fe2O3异质界面通过自发界面电子转移建立内建电场，优化了Cu位点的局域电子结构，强烈促进O-O吸附并在动力学上降低O-O键断裂活化能垒。Cu2O/Fe2O3释放的Fe3+可高效消耗细菌内高水平的小分子硫醇（BSH），从而摧毁其抵御脂质过氧化的核心防御机制。协同生成的Fe2+通过芬顿反应（Fenton reaction）及Cu2O/Fe2O3的过氧化物酶样（POD-like）活性触发类铁死亡，并直接破坏含铁硫簇（Fe-S cluster）的电子传递链（ETC）酶，从而阻断细菌能量代谢。此外，Cu+精准靶向并失活三羧酸循环（TCA cycle）中的关键酶——二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT），阻断还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）等电子供体的合成，在上游阶段彻底切断ETC的底物供应。同时，Cu+可置换Fe-S簇中的铁原子，导致NADH脱氢酶和琥珀酸脱氢酶结构破坏。本研究定义的类铜死亡本质上是铜诱导的、以TCA循环和氧化磷酸化功能障碍为特征的细菌死亡机制。简言之，类铁死亡和类铜死亡通过同时靶向ETC及其上游底物供应来破坏细菌能量代谢，从而实现高效抗菌。

论文解读

一、研究背景与意义

细菌感染长期以来一直是全球公共卫生领域的重大威胁。尽管抗生素的发现和应用曾大幅降低了感染相关死亡率，但耐药菌的持续蔓延使得传统抗菌疗法面临严峻挑战，尤其是在慢性感染和生物膜相关感染中，单一药物治疗往往疗效不佳。近年来，程序性细胞死亡（PCD）在抗感染领域的作用逐渐受到关注，多种形式的PCD（如焦亡、坏死性凋亡和铁死亡）已被探索应用于抗菌治疗。然而，病原体在进化过程中能够获得抑制或逃避多种细胞死亡通路的能力，依赖单一PCD通路的激活策略往往难以彻底清除病原体。此外，不同细菌感染所激活或易感的PCD类型存在差异，使得单一调控策略缺乏广泛适用性。因此，深入解析不同PCD在细菌感染中的调控机制，并开发能够协同利用多种PCD实现高效抗菌的策略，对于克服细菌耐药性和免疫逃逸具有重要意义。

铜死亡（cuproptosis）是一种新近发现的PCD形式，其通过铁氧还蛋白1（ferredoxin 1, FDX1）将Cu²⁺转化为Cu⁺，Cu⁺靶向三羧酸循环（TCA cycle）中关键脂酰化蛋白（如二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶，DLAT），诱导其异常寡聚化，并导致铁硫簇蛋白失活，最终引发细胞死亡。这些标志性分子事件主要集中于能量代谢的两个核心节点——TCA循环和电子传递链（ETC）。值得注意的是，铁死亡（ferroptosis）作为一种与ETC密切相关的PCD类型，也在抗菌治疗领域引起了广泛关注。然而，ETC对铁死亡的调控具有双向性和高度情境依赖性：它既可通过产生活性氧（ROS）促进铁死亡，也可通过生成还原型辅酶Q10抑制铁死亡，甚至在某些条件下不参与其中。因此，PCD与ETC在细菌中的相互作用机制，以及能否利用这种关系实现更高效的抗菌效果，仍有待深入探索。

二、研究概述

该研究发表于《Bioactive Materials》，成功构建了Cu₂O/Fe₂O₃异质结纳米酶，提出了一种协同诱导类铁死亡（ferroptosis-like death）和类铜死亡（cuproptosis-like death）的抗菌策略，通过靶向并抑制细菌能量代谢通路实现高效抗菌。研究综合运用了多种关键技术方法：采用液相还原法和水热法合成Cu₂O、Fe₂O₃及Cu₂O/Fe₂O₃纳米颗粒；利用扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、高分辨透射电子显微镜（HRTEM）、X射线光电子能谱（XPS）等手段对材料进行表征；通过密度泛函理论（DFT）计算揭示异质结界面的电子结构和H₂O₂分解动力学；采用酶动力学实验评估过氧化物酶样（POD-like）活性；利用电子自旋共振（ESR）检测羟基自由基（·OH）生成；通过代谢组学和RNA测序分析细菌代谢通路变化；构建小鼠烧伤感染模型评估体内抗菌和伤口愈合效果。

三、研究结果

2.1 材料制备与表征

研究人员通过液相还原法和水热法成功合成了Cu₂O、Fe₂O₃及Cu₂O/Fe₂O₃纳米颗粒，三者均呈立方体形貌，粒径约60 nm。XRD分析确认了纯相特征，HRTEM和选区电子衍射（SAED）进一步验证了Cu₂O/Fe₂O₃的晶体结构，晶面间距0.272 nm和0.204 nm分别对应Fe₂O₃的(104)面和Cu₂O的(200)面。XPS分析确认了Cu⁺和Fe³⁺的价态，排除了CuO杂相的存在。

2.2 增强的POD样活性源于界面相互作用和电子结构优化

通过TMB比色法验证了异质结增强的POD样活性，Cu₂O/Fe₂O₃的米氏常数（K_m）降至1.179 mM，最大反应速率（V_max）达3.104×10^?7 M/s，均优于单一组分。DFT计算表明，Cu₂O与Fe₂O₃的功函数差异驱动电子自发从Cu₂O向Fe₂O₃转移（约1.15 e），形成内建电场，优化了Cu位点的局域电子结构。H₂O₂在异质结表面的吸附自由能达?1.85 eV，O-O键断裂活化能垒降至0.45 eV，显著低于单一组分。ESR证实了更强的·OH信号。此外，Cu₂O/Fe₂O₃表现出高效的谷胱甘肽（GSH）清除能力，100 μg/mL浓度下25 min内即可完全消耗GSH。pH响应性释放实验表明，材料在pH 7.4下高度稳定，而在pH 5.0的酸性感染微环境中可持续释放Cu和Fe离子（72 h累积释放率分别约37%和19%）。

2.3 体外抗菌和抗生物膜效果

以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和大肠杆菌（E. coli）为模型菌株，100 μg/mL的Cu₂O/Fe₂O₃联合0.1 mM H₂O₂实现了对两种菌株超过95%的杀灭率。ROS染色、生长曲线、活/死菌染色、膜完整性检测和SEM形态观察均证实了Cu₂O/Fe₂O₃ + H₂O₂组具有最强的抗菌效果。与物理混合的Cu₂O&Fe₂O₃对照相比，异质结组的杀菌效果显著更优，证明抗菌性能源于异质结界面固有的协同机制。在抗生物膜实验中，Cu₂O/Fe₂O₃ + H₂O₂处理后MRSA和E. coli的残留生物膜量分别仅为14.135%和17.259%，CFU计数进一步证实了其对生物膜内细菌的彻底清除能力。

2.4 诱导细菌类铁死亡

FerroOrange染色显示Cu₂O/Fe₂O₃处理组细菌内铁离子水平显著升高。DTNB法检测显示细菌内还原型小分子硫醇（BSH）与氧化型（BSSB）的比例显著降低，表明BSH池严重耗竭。ELISA检测发现GPX样过氧化物酶活性下降，丙二醛（MDA）水平显著升高，C11-BODIPY^581/591探针染色证实了严重的脂质过氧化。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）剂量依赖性地挽救了细菌存活，明确证明脂质过氧化是细菌死亡的主要执行机制。研究指出，由于细菌缺乏哺乳动物GPX4的结构同源物，而是利用BSH依赖的硫醇过氧化物酶（如BsaA）防御脂质过氧化物，因此该机制被严格定义为"类铁死亡"。

2.5 类铜死亡与类铁死亡双通路协同杀菌

热图分析显示，Cu₂O/Fe₂O₃处理显著降低了DLAT和FDX1的蛋白丰度，表明脂酸代谢通路和铁硫簇蛋白受到严重破坏。ETC酶活性检测显示，Cu₂O/Fe₂O₃ + H₂O₂组中脱氢酶、末端氧化酶和ATP合酶的活性均显著降低。DiSC₃(5)探针检测证实了细菌膜电位的破坏。铜死亡抑制剂四硫代钼酸盐（TTM）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）均能有效抑制Cu₂O/Fe₂O₃的杀菌效果，进一步验证了类铜死亡通路的参与。研究同时承认，由于缺乏细菌特异性抗体，无法直接通过Western blot验证脂酰化蛋白的寡聚化，因此将这一机制严格定义为"类铜死亡"。

2.6 通过Cu₂O/Fe₂O₃抑制电子传递链

代谢组学分析鉴定出155种差异表达代谢物（23种上调，132种下调），KEGG富集分析显示糖酵解/糖异生、TCA循环、丙酮酸代谢、脂酸代谢和氧化磷酸化等通路显著下调。RNA测序鉴定出511个差异表达基因（218个上调，293个下调），GO分析揭示了金属离子应激响应等生物学过程的显著富集。线性扫描伏安法（LSV）证实Cu₂O/Fe₂O₃处理后细菌呼吸电流骤降至接近非生物基线水平，证明ETC被特异性阻断。NADH/NAD⁺比值升高表明NADH脱氢酶失活阻碍了电子传递。ATP水平显著降低，CTC染色显示细菌呼吸活性降至最低，BCECF染色揭示胞内碱化，表明质子动势（PMF）被破坏。

2.7 体内抗感染和伤口愈合效果

小鼠烧伤感染模型实验显示，Cu₂O/Fe₂O₃ + H₂O₂组在第9天的相对伤口面积仅为3.916%，远优于其他处理组。皮肤组织细菌培养证实该组细菌基本被清除。H&E染色显示炎症细胞浸润显著减少，Masson染色显示胶原纤维排列更整齐。转录组分析揭示了炎症反应和免疫调控相关通路（IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路等）的显著富集。ELISA检测显示促炎细胞因子TNF-α和IL-1β水平显著降低（分别约42 pg/mL和25 pg/mL），而抗炎细胞因子IL-10和促修复因子TGF-β水平显著升高（分别约140 pg/mL和949 pg/mL）。免疫荧光染色显示，第9天时DLAT和LIAS的表达在各组间无持续差异，表明纳米酶在急性杀菌后不会对周围健康宿主组织造成持续性氧化应激或代谢紊乱。CD31/VEGF和α-SMA/Collagen共染证实了Cu₂O/Fe₂O₃组具有最强的血管生成和细胞外基质沉积能力。主要器官H&E染色和血液参数均无异常，证实了材料的体内生物安全性。

四、研究结论

本研究成功构建了Cu₂O/Fe₂O₃异质结纳米酶，通过DFT计算揭示了异质界面内建电场对POD样活性的增强机制。该纳米酶通过释放Fe³⁺消耗细菌内BSH、Fe²⁺触发芬顿反应诱导类铁死亡，同时Cu⁺靶向DLAT和Fe-S簇蛋白诱导类铜死亡，双通路协同阻断ETC及其上游底物供应，彻底破坏细菌能量代谢，实现高效抗菌。体外实验证实了该体系对MRSA和E. coli及其生物膜的优异清除能力，体内实验证明了其促进烧伤感染伤口愈合的显著效果和良好的生物安全性。该研究为利用多种PCD协同抗菌提供了新策略，为应对细菌耐药性挑战提供了重要思路。