面向腺病毒载体制造的悬浮HEK293细胞培养过程原位拉曼光谱实时监测细胞密度与关键代谢物

《Biochemical Engineering Journal》：In-situ Raman spectroscopy for real-time monitoring of cell density and metabolites during adenovirus production in HEK293 suspension culture

原位拉曼光谱（in-situ Raman spectroscopy）用于悬浮HEK293细胞培养中腺病毒（adenovirus）生产过程中细胞密度和代谢物的实时监测。在生物反应器批次中在线采集拉曼光谱，并开发偏最小二乘（partial least squares, PLS）模型，以监测采用悬浮HEK293细胞的腺病毒载体（adenoviral vector, AdV）生产中的活细胞密度、总细胞密度及关键代谢物。该模型能够准确、连续地预测细胞密度和主要代谢物，并在连续预测中捕捉补料事件和稀释效应，尽管病毒感染和细胞裂解引起了生理变化。总体而言，该工作证明了原位拉曼光谱作为腺病毒载体制造过程分析技术（process analytical technology, PAT）的稳健性，并支持将其整合到先进监测和工艺优化策略中。

研究背景：腺病毒（adenovirus, AdV）载体在COVID?19大流行中成为有效且快速响应的疫苗平台之一，并被临床评估用于多种病原体疫苗及溶瘤治疗。复制缺陷型AdV大规模生产依赖表达腺病毒E1基因的悬浮适应HEK293细胞。然而腺病毒制造尚未完全优化，主要限制包括细胞密度效应（cell density effect, CDE），即在高活细胞密度（viable cell density, VCD）下感染时细胞特异性病毒产量下降；营养耗竭和代谢副产物积累被认为参与其中。为维持体积生产率，AdV生产常采用补料分批或灌流模式，因此实时监测细胞密度和关键营养对确定补料策略和感染时机至关重要。AdV为裂解性病毒，宿主细胞裂解后释放的病毒颗粒在24–45 h内可失去高达50%感染性，及时监测细胞死亡动力学和病毒生产对产品质量和收获产量重要。过程分析技术（process analytical technology, PAT）尤其在线监测已用于实时监测关键过程参数（critical process parameters, CPPs）和关键质量属性（critical quality attributes, CQAs）。但AdV生产具有生长相和感染相两阶段复杂性，感染改变宿主细胞生理，使电容和摄氧率等基于物理化学性质的细胞密度指标偏离实际VCD；感染期稳健监测仍具挑战。拉曼光谱作为在线PAT，通过激光激发非弹性散射探测分子振动模式，光谱多变量并可用化学计量模型关联过程变量，偏最小二乘（partial least squares, PLS）回归最常用。拉曼已在CHO细胞单克隆抗体生产等监测细胞密度和营养，但AdV制造涉及感染和裂解；病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）生产中有模型跨感染期精度降低、滴度直接监测有限的报道。因此研究人员评估原位拉曼光谱监测悬浮HEK293细胞AdV生产生长和感染两阶段的细胞密度和关键代谢物，基于六批生物反应器开发目标特异性PLS模型并与全范围模型比较，用嵌套批间交叉验证评估未见批次性能。其意义在于支持将原位拉曼作为AdV制造PAT并整合到先进监测和工艺优化。

关键技术方法：六批3 L搅拌罐生物反应器（B1–B6），HEK293SF?3F6细胞（National Research Council Canada）悬浮培养，感染编码Newcastle disease virus融合蛋白的腺病毒载体；在线ProCellics Raman Analyzer（785 nm，约350 mW，100–4000 cm^?1，3 cm^?1分辨率，每30 min采集，15次累积×30 s）；离线Vi?Cell XR测VCD和总细胞密度（total cell density, TCD），Bioprofile FLEX2测葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸、乳酸和铵，TCID₅₀测感染性病毒颗粒（infectious viral particle, IVP），高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）测病毒颗粒（viral particle, VP）；采用主成分分析（principal component analysis, PCA）、标准正态变量（standard normal variate, SNV）归一化、Savitzky–Golay一阶导数、目标特异性PLS、嵌套留一批交叉验证、变量投影重要性（variable importance in projection, VIP）和Spearman相关。

研究结果：
3.1 拉曼光谱分析与预处理：通过六批在线光谱PCA和代表性原始/预处理光谱分析，研究人员发现光谱信号稳定一致，除纯培养基和B2延长细胞死亡区样品外无明显强离群点；PCA得分随细胞生长和感染变化，原始光谱背景随生长降低、随死亡升高，经SNV水带参考及Savitzky–Golay一阶导数预处理后背景去除、峰更清晰；417、576、750 cm^?1来自蓝宝石探头窗口，855、1010、1350、1620 cm^?1等为主要峰。结论是预处理可稳定光谱并用于后续建模。
3.2 嵌套交叉验证中的模型配置与选择：通过嵌套留一批交叉验证在各目标内选择SNV参考、光谱范围和潜变量数，研究人员发现VCD和TCD模型常选择1000–1200 cm^?1等区域，共识VIP峰位于525、1002、1026、1176、1344 cm^?1（VCD）和1002、1026、1176、1344、1620 cm^?1（TCD）；葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、铵和谷氨酸模型也选择与代谢物指纹相关的区域，谷氨酸所选范围批间变化最大；内层RMSE_CV显示细胞密度和主要代谢物模型精度较高，谷氨酸R_CV²低与其浓度范围窄有关。结论是目标特异性变量选择与拉曼谱带对应，增强模型特异性和可解释性。
3.3 模型预测：通过用未参与该批建模的留出批进行连续预测，研究人员发现合并六批RMSE_P为VCD 0.63×10⁶ cells/mL（R_P²=0.80）、TCD 0.44×10⁶ cells/mL（0.94）；代谢物RMSE_P为葡萄糖1.18 mM（R_P²=0.99）、乳酸2.11 mM（0.98）、谷氨酰胺0.65 mM（0.86）、铵0.39 mM（0.83），谷氨酸0.45 mM且合并R_P²为负（?0.37）；葡萄糖和乳酸连续预测可重现补料和稀释引起的阶跃变化，谷氨酰胺补料未清晰重现，B2延长死亡期和B6感染后VCD误差较大。结论是模型可准确连续监测多数目标，但谷氨酸和部分动态仍有局限。
3.4 分阶段性能及与全范围模型的比较：通过分别计算感染前和感染后RMSE_P及相对RMSE_P，研究人员发现VCD和TCD在六批中五批感染后绝对误差更高，但合并rRMSE_P约11%（VCD）和7%（TCD）；葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、铵、谷氨酸合并rRMSE_P约3%、11%、4%、8%、9%；与同一嵌套流程的全范围基线相比，目标特异性选择降低VCD（11% vs 15%）、TCD（7% vs 8%）、葡萄糖（3% vs 4%）和乳酸（4% vs 5%）的合并误差，铵和谷氨酸相似，谷氨酰胺略高（11% vs 10%）。结论是目标特异性模型总体改善细胞密度、葡萄糖和乳酸预测。
3.5 病毒滴度：通过相同嵌套流程对IVP（30个样品）和VP（34个样品）滴度建模，研究人员发现未转换滴度模型预测不确定性与滴度同量级且部分预测无信息；log₁₀转换后合并RMSE_P为0.86 log₁₀(IVP/mL)和0.54 log₁₀(VP/mL)，约为TCID₅₀分析不确定度（0.15 log₁₀）和HPLC（0.09 log₁₀，相当于23%）的六倍，R_P²均为负。结论是未能建立可用滴度模型。

讨论部分总结：讨论指出PCA得分时间演变可反映培养状态，方向性移动发生在VCD/TCD达峰及葡萄糖/谷氨酰胺耗竭之前，且并非由感染诱导；B3和B5在较低密度感染却获得最高和第二高细胞特异性VP/IVP产量，拉曼PCA轨迹能否用于选择感染时机以缓解CDE仍是待设计实验验证的假设。葡萄糖和乳酸高精度可能源于直接分子拉曼贡献，所选波数接近文献指纹；谷氨酰胺模型共享峰并包含酰胺振动区，但该峰归属仍暂定且谷氨酰胺与葡萄糖强相关，预测可能部分间接；铵的重要VIP峰不对应其N–H变形带，而与谷氨酰胺模型共享有机分子峰，提示铵预测间接由谷氨酰胺驱动，符合铵为谷氨酰胺消耗主要副产物；谷氨酸模型不能泛化与谱带重叠、浓度变化窄（约3–5 mM）及与其他变量弱相关有关。VCD/TCD所选范围对应细胞组分，其共识VIP峰与葡萄糖/谷氨酰胺模型重合，符合生长相细胞密度与葡萄糖/谷氨酰胺强相关（|ρ|=0.91–0.95）；感染后相关性减弱，可能解释部分批次VCD感染后精度下降；TCD因包含死亡细胞生物量仍贡献拉曼信号且感染后与葡萄糖/谷氨酰胺相关性更强而预测更准。滴度模型差不能仅归因于样品数有限；该培养滴度下AdV颗粒预计不能产生可与细胞或培养基区分的拉曼信号，滴度预测应依赖间接光谱信息，且AdV生产多步骤、滴度感然后呈S形，中间滴度依赖胞内步骤而无直接光谱痕迹。

研究结论翻译：本研究评估了3 L规模悬浮HEK293培养AdV生产过程中原位拉曼光谱监测细胞密度和关键代谢物的能力。在六批嵌套留一批交叉验证中，目标特异性PLS模型对每个留出批的生长和感染两阶段均预测了活细胞密度、总细胞密度、葡萄糖、乳酸、铵和谷氨酰胺，并在连续预测中重现补料和稀释事件，而谷氨酸和病毒滴度无法预测。VCD预测在感染后细胞死亡期间最不准确。在模型训练中嵌套选择每个目标的SNV参考和光谱范围，与共同全范围模型相比降低了细胞密度、葡萄糖和乳酸的预测误差；跨折一致选择的拉曼位移有助于解释模型。这些结果支持原位拉曼光谱作为AdV生产两阶段实时监测的可行工具。未来需要将校准扩展到更多批次、规模和工艺条件，改善裂解期活细胞监测，并评估其在补料、感染时机和收获决策中的应用。