《Biochemical Pharmacology》：Revealing NMN-induced biomacromolecular complex and conformational regulation of digestive enzymes (Trypsin, Pepsin, α-Amylase): Insights from molecular dynamics simulation and multi-spectroscopy
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摘要烟酰胺单核苷酸（NMN）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的关键前体，因其潜在的抗衰老作用而备受关注。作为口服活性分子，NMN 不可避免地会与胃肠道中的消化酶发生相互作用，这可能会影响其生物利用度、稳定性和生理功能。然而，NMN 与消化酶之间的相互作用尚未得到系统表征。本
摘要
烟酰胺单核苷酸（NMN）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的关键前体，因其潜在的抗衰老作用而备受关注。作为口服活性分子，NMN 不可避免地会与胃肠道中的消化酶发生相互作用，这可能会影响其生物利用度、稳定性和生理功能。然而，NMN 与消化酶之间的相互作用尚未得到系统表征。本研究采用多种光谱技术、分子对接和分子动力学（MD）模拟，对 NMN 与三种消化酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶和 α-淀粉酶）的结合进行了研究。荧光猝灭分析表明，NMN 通过自发结合诱导了三种酶的静态猝灭。热力学分析显示，疏水作用辅以氢键是主要驱动力。分子对接表明，NMN 嵌入疏水腔中，并通过氢键和疏水作用与周围残基稳定结合。同步荧光、紫外–可见吸收、圆二色性（CD）和共振光散射（RLS）分析表明，NMN 改变了芳香族残基的微环境并诱导了构象重排。分子动力学模拟证实了 NMN–酶复合物的结构稳定性，其中 NMN–胃蛋白酶体系表现尤为突出，具有最低均方根偏差（RMSD）和较小的回转半径（Rg）。功能实验显示消化酶活性呈浓度依赖性抑制，其中胃蛋白酶敏感性最强。此外，复合物形成后抗氧化能力下降，而抗炎活性增强。这些发现从机制层面为体外条件下 NMN 与消化酶之间的相互作用提供了洞见，有助于阐明 NMN 在消化、转运和代谢过程中的作用，对药物设计与开发具有重要的指导意义。
引言
生物大分子（包括合成聚合物和天然蛋白质）在生物过程及生物技术应用中发挥着至关重要的作用[1]。天然酶作为典型的生物大分子，具有类似于聚合物的构象柔性[2]，例如 α-螺旋和 β-折叠等折叠模式以及聚合物链的排列方式。它们与小分子的相互作用对于理解生物大分子复合物[3] 具有重要意义，同时也有助于理解功能性物质在体内的代谢与释放[4]。α-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等消化酶在营养物质溶液中营养物质的水解和代谢调控中发挥着关键作用[5]。胰蛋白酶（图 1）是一种典型的丝氨酸蛋白酶，在蛋白质水解催化方面具有高特异性，并参与蛋白质的分解代谢[6]、[7]、[8]。胃蛋白酶（图 1）是胃液中最为突出的天冬氨酸蛋白酶，也是胃液中唯一存在的蛋白质水解酶[9]、[10]。其活性中心结构以保守的酪氨酸和色氨酸残基为特征[11]。在药物研究中，胃蛋白酶与口服治疗性药物之间的潜在相互作用尤为重要[12]、[13]。α-淀粉酶（图 1）是一种关键的碳水化合物代谢酶[14]，能够催化淀粉分子内 α-1,4-糖苷键的水解反应[15]、[16]。鉴于其生物学意义，阐明 NMN 在体外如何与消化酶结构相互作用，有助于在分子水平上理解其结合行为，并指导未来对 NMN 生物利用度和生理功能的评价，从而为其抗衰老和代谢调控提供理论支持。
烟酰胺单核苷酸（NMN，图 1）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的关键前体，因其在代谢调控、神经保护和健康衰老中的潜在作用而日益受到关注[17]、[18]。补充 NMN 可增强各组织中 NAD+ 的生物合成[19]，从而促进其在能量代谢、细胞周期调控、NAD+ 修复和细胞衰老中的酶功能[20]、[21]。近期关于 NMN 口服代谢途径的研究主要集中于其由肠道菌群进行的生物转化[22]。然而，NMN 是一种口服小分子，消化酶是口服 NMN 遇到的第一个生物化学屏障，这将会影响 NMN 的稳定性、生物利用度及其后续的代谢命运。本研究选取胃蛋白酶、胰蛋白酶和 α-淀粉酶作为代表性的消化酶，分别对应胃中的蛋白质水解、肠道中的蛋白质水解以及碳水化合物消化。研究这三种酶有助于确定 NMN 与消化酶之间是否存在共同的相互作用机制，以及其结合和抑制效应。然而，NMN 与消化酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶、α-淀粉酶）在胃肠道中最初的且不可避免的相互作用在很大程度上被忽视了[23]，其潜在的相互作用机制也尚未得到探索。因此，本研究为 NMN 与关键消化酶的相互作用提供了重要的洞见。
近年来，许多研究对小分子药物与消化酶的结合进行了表征。例如，Osman 报道二氯尼索唑主要通过范德华力和氢键与胃蛋白酶结合[13]。Wang[24] 证明盐酸米诺环素会诱导胰蛋白酶的静态猝灭和构象变化。Ma[25] 确定氢键是倍半萜内酯抑制 α-淀粉酶的关键驱动力。鉴于 α-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶在人体消化系统中的重要性，本研究整合多光谱分析、分子动力学（MD）模拟和酶活性测定方法，揭示了活性小分子 NMN 与三种关键消化酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶和 α-淀粉酶）之间的相互作用机制。这种多维度、多尺度的研究策略可以相互验证和补充，从而有助于阐明 NMN 与生物大分子相互作用所遵循的规律。本研究获得了有关猝灭机制、结合亲和力、主要驱动力、构象变化以及 NMN 诱导的复合物稳定性中关键氨基酸残基贡献的信息。除了填补当前有关 NMN 与消化酶相互作用的知识空白外，还为小分子介导的天然大分子复合物提供了新的洞见。本研究还为 NMN 相关抗衰老药物的设计、功能食品开发、药代动力学及相互作用机制提供了可用的数据。
各节摘录
材料
NMN（纯度 97%）购自北京索莱宝科技有限公司。NMN 由双蒸馏水配制成 1.00 × 10-2 mol/L。胰蛋白酶（猪胰）购自上海麦克林生化科技有限公司。胃蛋白酶（猪胃黏膜）和 α-淀粉酶（猪胰）购自上海源叶生物科技有限公司。所有蛋白质均以 Tris-HCl 缓冲液（0.05 mol/L，pH = 7.40）为溶剂溶解，浓度为 1.00 × 10-4 mol/L。卵清蛋白（OVA）
与 NMN 相互作用后胰蛋白酶、胃蛋白酶、α-淀粉酶微形貌的变化
扫描电镜（SEM）是提供关于小分子结构和配体–酶相互作用的多种信息的一种有用工具[31]。如图 2 所示，SEM 结果显示 NMN 的相互作用改变了消化酶的微结构。在原始状态下，胰蛋白酶表面光滑并带有波浪状起伏，椭圆形空腔均匀分布。胃蛋白酶呈现出独特的层状结构，表面具有不规则突起。α-淀粉酶则表现为不规则的颗粒聚集体。之后
讨论
对 NMN 与胰蛋白酶、胃蛋白酶和 α-淀粉酶的结合情况进行了比较和分析。在三种酶中，胃蛋白酶表现出最高的结合亲和力、最小的 RMSD 和最强的抑制作用，表明胃蛋白酶与 NMN 之间的相互作用最为显著。相比之下，胰蛋白酶和 α-淀粉酶表现出较弱的响应。尽管存在这些定量差异，疏水作用和氢键在所有三个体系中仍起主导作用。NMN 与
利益冲突声明
作者声明，他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。
致谢
五粮液集团有限公司与四川理工学院合作项目（编号：CXY2022ZR006）、四川理工学院研究生教育教学改革研究项目（编号：JG202313、JG202437）。
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