F-30作为FGFR2/4选择性共价抑制剂的表征及其对临床相关突变的活性

《Biochemical Pharmacology》：Characterization of F-30 as an FGFR2/4-selective covalent inhibitor with activity against clinically relevant mutations

　　

摘要

成纤维细胞生长因子受体（FGFR）FGFR2和FGFR4在多种癌症中是致癌驱动因素，然而目前大多数已批准的FGFR抑制剂缺乏亚型选择性，且容易产生获得性耐药性。在此，我们鉴定了F-30，据我们所知，这是首个通过共价靶向保守的P-loop半胱氨酸、对FGFR2和FGFR4均具有优先活性的共价抑制剂。结构分析表明，P-loop及周围结合环境的差异性相互作用有助于旁系同源物识别。与这些结构观察一致，F-30对FGFR2的K_I约为FGFR1的12倍低，而k_inact/K_I则约为13倍高，二者的k_inact值则相当。这些结果表明，F-30对FGFR2而非FGFR1的偏好性主要在共价结合前的识别阶段建立。F-30对多种临床相关的FGFR2耐药相关突变仍保持强效活性，但对守门员突变的效力有所降低。在细胞模型中，F-30优先抑制FGFR2/4驱动的癌细胞增殖，而在FGFR1和FGFR3驱动的模型中观察到的通路抑制作用显著弱于FGFR2依赖性细胞。综合以上结果，本研究揭示了有助于F-30亚型选择性谱的结构和动力学特征，可能为设计靶向保守P-loop半胱氨酸的共价FGFR抑制剂提供指导。

引言

成纤维细胞生长因子受体（FGFR）家族受体酪氨酸激酶包含四个高度保守的成员（FGFR1-4），通过激活包括RAS-MAPK、PI3K-AKT和PLCγ在内的下游信号通路，调控增殖、分化和存活等基本细胞过程[1]、[2]。FGFR信号通路的失调，通过基因扩增、融合或激活突变，已被证实是广泛谱系人类癌症的驱动因素[3]、[4]。值得注意的是，FGFR2和FGFR4在特定恶性肿瘤中发挥着特别关键且不同的作用。FGFR2的遗传改变常在内胆管癌、子宫内膜癌和胃癌中被发现[5]、[6]、[7]。相反，FGFR4的异常激活，通常由配体FGF19过表达驱动，是约30%肝细胞癌的关键致癌驱动因素，并与侵袭性肿瘤行为和不良预后相关[8]、[9]。

然而，对于靶向抑制剂而言，一个关键挑战是FGFR家族成员之间的显著序列和结构相似性。目前FDA批准的药物主要是泛FGFR抑制剂，同时靶向FGFR1-4的ATP结合口袋[3]、[10]。它们广泛的FGFR活性可能导致基于机制的毒性，特别是高磷血症和异位钙化，这可能会限制最佳剂量的使用[3]、[11]。此外，长期施用这些抑制剂可能导致获得性耐药的出现。以FGFR2为例，激酶结构域内的二次突变，包括分子刹车激活突变（如N549K/H/D、E565A、K641R）和守门员突变（如V564F/I/L/M），代表临床耐药的主要机制[4]、[12]、[13]、[14]、[15]。这些局限性凸显了对具有改善旁系同源物选择性和针对临床相关耐药突变活性的FGFR抑制剂的需求。

在激酶抑制剂设计中实现高效力和选择性的一个引人注目的策略是通过共价弹头靶向ATP口袋内的半胱氨酸残基[16]。保守的P-loop半胱氨酸（FGFR1中的Cys488，FGFR2中的Cys491，FGFR3中的Cys482，FGFR4中的Cys477）已被成功利用。这种方法产生了强效的不可逆泛FGFR抑制剂，如含有丙烯酰胺的futibatinib（TAS-120）和PRN1371[17]、[18]（图1上）。最近，通过利用结构动态变化，开发出了带有甲基丙烯酰胺基团的亚型选择性FGFR2共价抑制剂（如lirafugratinib（RLY-4008）和BW710）[19]、[20]、[21]。这些抑制剂专门靶向FGFR2的Cys491位点，证明了即使是针对保守残基也可以实现亚型特异性。

与此同时，FGFR4铰链环内独特的半胱氨酸残基（Cys552），该残基在FGFR1-3中不存在，已作为开发FGFR4选择性抑制剂的替代锚点[22]。典型的抑制剂包括基于丙烯酰胺的fisogatinib（BLU-554）和CXF-007，以及含有醛基的FGF401（Roblitinib）和10z，它们均通过不可逆或可逆靶向FGFR4的Cys552来实现选择性[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]（图1下）。尽管靶向铰链区内的非保守半胱氨酸已被证明是实现FGFR4特异性的有效方法，但通过靶向FGFR4中保守的P-loop半胱氨酸（Cys477）进行共价抑制仍未被探索，迄今为止也没有报道过通过该位点实现FGFR4选择性的抑制剂。

此前，我们开发了F-30，一种含有2-氯乙酰氨基弹头的强效共价FGFR4抑制剂[29]（图1右）；然而，其精确的靶向半胱氨酸残基和分子机制仍有待阐明。在本研究中，我们鉴定F-30为首个靶向该位点的FGFR2/4选择性共价抑制剂。我们的工作确立了F-30作为一个有用的先导化合物骨架，并为设计靶向保守P-loop半胱氨酸的亚型选择性共价FGFR抑制剂提供了结构框架。

章节摘要

质粒构建

所有质粒均按照此前描述的方法制备[26]、[30]。简言之，人FGFR1（残基456-765）、FGFR2（残基465-763）、FGFR3（残基450-758）和FGFR4（残基445-753）的激酶结构域被克隆到改良的pET28a载体中，带有N端6×His标签，随后是PreScission蛋白酶切割位点。然后使用野生型蛋白表达载体设计引物进行定点突变，构建突变蛋白表达向量。

F-30优先抑制FGFR2和FGFR4

为了系统评估共价化合物F-30对FGFR家族成员的效力和选择性，我们首先使用非共价化合物F-29作为对照进行了激酶抑制实验。如表1所示，F-30对FGFR2和FGFR4表现出强效抑制活性，IC₅₀值分别为7.8 nM和11 nM。相比之下，其对FGFR1（IC₅₀ = 315 nM，与FGFR2/4相比效力低40/28倍以上）和FGFR3（IC₅₀ = 91 nM，与FGFR2/4相比效力低11/8倍以上）的活性较弱。

讨论

F-30的设计始于泛FGFR抑制剂fexagratinib（AZD4547），最初的目的是开发一种共价FGFR4选择性抑制剂[29]、[43]。结构修饰引入了氨基吲唑骨架和2-氯乙酰氨基弹头，最初旨在靶向FGFR4特异性的Cys552。然而，我们的质谱和结构分析表明，F-30反而共价结合FGFR家族成员中保守的P-loop半胱氨酸。尽管

CRediT作者贡献声明

Lin Zhang：形式分析、撰写初稿。Xueru Liu：方法学。Wuqing Deng：资源。Tanyuxuan Yang：调查。Ke Gui：资源。Yuepiao Cai：资源。Yongheng Chen：. Xiaojuan Chen： .

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文报道工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82202920、82504555和82172654）、中国博士后科学基金（编号：2026M793893）和湖南省自然科学基金（2021JJ40961）的资金支持。我们感谢上海同步辐射光源（SSRF）BL17U/BL19U/BL02U/BL10U/BL17光束线的工作人员在衍射数据收集期间提供的协助。

Lin Zhang|Xueru Liu|Wuqing Deng|Tanyuxuan Yang|Ke Gui|Yuepiao Cai|Yongheng Chen|Xiaojuan Chen