细菌中甲基萘醌类的分布、功能与生物合成研究进展

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：Menaquinones in bacteria – occurrence, function and biosynthesis

　　

甲基萘醌类（Menaquinones，MKs），通常被称为细菌中的呼吸醌，存在于大多数细菌物种中，并在结构上表现出极大的多样性，包括侧链长度、饱和度、环甲基化及其他修饰。MKs在细菌中的功能主要归因于其在厌氧呼吸中的作用，但其潜在的电子供体和受体种类非常丰富。然而，它们的功能远不止参与呼吸作用。例如，它们还参与细菌光合作用、介导胞外电子传递或参与细胞信号传导。此外，细菌的呼吸性MK库还是DsbA-DsbB双组分系统的电子受体，该系统参与多种目标蛋白质中二硫键的形成。经典的以及一种新的细菌MK生物合成途径——即所谓的叶绿醌酮途径（futalosine pathway），最近已被全面阐明，几乎所有酶促步骤均已被识别，其中一些步骤展现出独特的催化机制。最后，本文还介绍了MK测定的分析方法实例，包括实用提示。

细菌中甲基萘醌类的分布、功能与生物合成研究进展

一、研究背景与研究目的

维生素K（Vitamin K，VK）化合物是一类以2-甲基-1,4-萘醌核为共同结构特征的脂溶性分子，广泛存在于从细菌到哺乳动物及高等植物的几乎所有生物体中。在人类中，VK主要参与凝血和骨代谢，同时也影响能量代谢、大脑发育，并具有抗癌等多种积极作用。细菌中的甲基萘醌类（Menaquinones，MKs，又称VK₂）是主要的呼吸醌，其侧链由不同数量的异戊二烯单元组成，通常不饱和，但也存在部分甚至完全饱和的侧链。相比之下，叶绿醌（Phylloquinone，PhQ，VK₁）则含有一个单不饱和的植基侧链。

尽管对MKs的研究已有多年历史，但仍存在若干亟待解决的科学问题。首先，MKs在细菌中的功能远不止传统的厌氧呼吸作用，其在光合作用、胞外电子传递及细胞信号传导中的具体角色尚需进一步阐明。其次，MKs的生物合成途径除了经典途径外，近年来发现了一条全新的叶绿醌酮途径（futalosine pathway），但其后期反应步骤仍未完全解析。此外，某些蓝细菌中缺乏已知MK生物合成途径的基因组证据，却仍能合成MK-4，暗示可能存在第三条尚未被发现的合成路径。同时，稀有MKs如氯菌醌（Chlorobiumquinone，ChQ）、甲硫醌（Methionaquinone，MTQ）及氢化MKs的生物合成机制也尚待探索。由于许多致病细菌仅依赖MKs作为呼吸醌，因此MK生物合成途径成为开发新型抗生素的重要潜在靶点。

基于上述背景，本综述旨在系统总结细菌中MKs的分布、功能及生物合成的最新研究进展，重点涵盖经典途径与叶绿醌酮途径的酶学特征、MKs在呼吸与光合电子传递链中的作用、DsbA-DsbB双组分系统与MK库的偶联关系，以及VK的分析检测方法，从而为该领域的未来研究方向提供参考。

二、关键技术方法

研究人员在综述中汇总了多项关键技术方法用于MKs的研究与测定。在MKs的分离与定量方面，最常用的方法是高效液相色谱法（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC），采用反相色谱柱进行分离。为提高检测的选择性和灵敏度，研究人员采用了柱后还原荧光检测法：在分析柱后安装填充锌粉的柱后还原柱，将氧化态的VK在线还原为其强荧光的还原形式，激发波长为238-248 nm，发射波长为418-430 nm。流动相中添加乙酸钠、乙酸和氯化锌以保证还原效率。此外，电化学检测法和质谱法（Mass Spectrometry，MS）也被应用于VK的定性与定量分析，其中液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）可用于分子量确认。在MK生物合成研究中，研究人员综合运用了生物信息学分析、诱变技术、放射性同位素标记及基因工程等手段，特别是对叶绿醌酮途径中多个酶进行了克隆、体外活性验证及晶体结构解析。

三、研究结果

1. 分布与功能

Collins和Jones对近700种细菌菌株的调查显示，MK-7和MK-8最为常见，但含有1至14个异戊二烯单元的MKs均有发现。古细菌富含具有完全饱和侧链的MKs，而部分革兰氏阳性菌中常出现部分饱和的氢化MKs。脱甲基甲基萘醌类（Demethylmenaquinones，DMKs）存在于兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌中，在某些物种中甚至是唯一的呼吸性异戊二烯醌。近期还在古细菌中鉴定出了含额外甲基化的甲基MKs（Methyl-MKs，MMKs）和二甲基MKs（Dimethyl-MKs，DMMKs）。甲硫醌存在于Aquifex-Hydrogenobacter分支及嗜酸热原体（Thermoplasma acidophilum）中。氯菌醌是绿色硫细菌中特有的MK衍生物，主要存在于绿体中。人类粪便中也检测到了丰富的MK同系物（MK-4至MK-15），来源于肠道细菌。值得注意的是，部分专性发酵细菌（如多数乳酸杆菌属和链球菌属）已丧失合成MK的能力。

MKs在细菌呼吸电子传递链中扮演核心角色，充当多种呼吸蛋白复合物之间的电子载体。以大肠杆菌（Escherichia coli）和希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）为例，其异戊二烯醌库可包含MKs、DMKs和泛醌（Ubiquinones，UQ），展现出高度灵活性。嗜酸热原体在厌氧条件下，其总醌库中97%为TPQ-7（即MMK-7），而在有氧条件下三种醌含量相近。乳酸乳球菌（Lactococcus cremoris）主要产生长链MKs（MK-8和MK-9）用于呼吸，同时也合成少量MK-3，后者优先介导胞外电子转移。

MKs还参与细菌光合作用，存在于紫色细菌和绿色丝状细菌的光系统II型反应中心，以及绿色硫细菌和太阳杆菌的光系统I型反应中心。在绿硫细菌Chlorobium tepidum中，MK-7主要作为细胞质膜光系统I型反应中心的电子载体，而氯菌醌则作为绿体天线中氧化还原敏感的能量淬灭剂。

此外，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中MK参与了固氮作用的氧感应调控。在大肠杆菌中，厌氧条件下MK分子作为DsbA-DsbB双组分系统的电子受体，该系统负责周质空间中目标蛋白质的二硫键形成，电子从底物蛋白的半胱氨酸经DsbA和DsbB传递至MK，随后进入呼吸链。

2. 生物合成

大肠杆菌中MK-8的经典生物合成途径已被充分阐明。莽草酸途径产生的分支酸（chorismate）是早期中间体，大部分酶位于细胞质中。最新鉴定的酶是DHNA-CoA硫酯酶（MenI）。侧链长度由多异戊二烯焦磷酸合酶决定，该类酶的FARM基序及其邻近区域的氨基酸残基对产物链长起关键作用。

第二条途径即叶绿醌酮途径存在于约13%-16%的细菌物种中，包括天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）和嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）。该途径的关键中间体氨基叶绿醌酮和叶绿醌酮的核苷部分来源于S-腺苷甲硫氨酸。其中MqnE是一种独特的自由基SAM酶，催化氨基叶绿醌酮的形成；MqnC是依赖[4Fe-4S]簇的自由基SAM环化酶，催化形成螺环化合物DHFL。对超过26,000个细菌基因组的分析表明，叶绿醌酮途径分布于更广泛的细菌目（293个目），而经典途径分布在208个目中，两种途径基本互斥，仅有20个基因组同时含有两种途径的证据。

关于稀有MKs的生物合成，MenJ已被证实可催化结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）中MK-9第二个异戊二烯单元的加氢饱和。某些蓝细菌如Gloeobacter violaceus和Anthocerotibacter panamensis合成MK-4而非PhQ，但缺乏已知MK生物合成途径的基因组证据，提示可能存在另一条替代途径。

四、讨论与结论

尽管多年来已知VK在脊椎动物、细菌和光合生物中分别发挥凝血辅因子、呼吸醌和光合电子传递链组件的功能，但近期才在这些领域取得进一步突破。在细菌中已鉴定出大量结构多样的MK衍生物，参与各种厌氧呼吸链。新发现的叶绿醌酮途径已被详细描述，成为新型抗生素的潜在靶点。细菌中与呼吸性MK库偶联的DsbA-DsbB双组分系统已被详细表征，该系统在所有生命谱系中均存在功能同源物。

未来的研究方向包括：为何只有哺乳动物的DsbA-DsbB同源物（VKOR）能够还原VK环氧化物，而细菌和光合生物的酶则不能；叶绿醌酮途径后期的MK生物合成步骤有待阐明；可能存在于某些蓝细菌中的新MK生物合成途径有待发现；以及稀有MKs包括侧链饱和同系物的生物合成机制有待探索。