NQO1作为原发性硬化性胆管炎中氧化应激和胆管纤维化的上下文依赖性调节因子

《Hepatology Communications》：NQO1 acts as a context-dependent regulator of oxidative stress and biliary fibrosis in primary sclerosing cholangitis

　　

背景：原发性硬化性胆管炎（PSC）仍是一种具有挑战性的胆道疾病，以持续性炎症和广泛性纤维化为特征。然而，其分子驱动因素尚未完全阐明。在此，我们探索了NAD(P)H：醌氧化还原酶1（NQO1）在PSC进展中的功能意义。方法：野生型（WT）和Nqo1基因敲除（NKO）雄性小鼠饲喂含0.1%（w/w）3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡咯（DDC）的饮食1周或3周，以诱导胆汁淤积性肝损伤。收集肝组织和血浆样本进行生化、组织学和分子分析。为进一步探究潜在机制，使用HepG2和LX-2细胞系以及原代肝细胞进行了体外实验。结果：在胆汁淤积条件下，NQO1表达显著上调。在DDC诱导损伤的急性期，NKO小鼠表现出保护性表型，其特征是血浆ALT水平显著降低，且与WT对照组相比，组织学损伤更轻。组织学分析进一步显示，NKO小鼠中TUNEL阳性肝细胞减少，纤维沉积减轻。转录组分析表明，NQO1缺失抑制了上皮-间质转化（EMT）和炎症通路，同时增强了胆汁酸和异生物代谢。机制上，骨膜素被鉴定为一个关键上游因子，能够诱导NQO1表达并促进细胞内活性氧（ROS）积累。骨膜素诱导的NQO1蛋白表达被BAY 11-7082和N-乙酰-L-半胱氨酸所减弱。值得注意的是，NQO1的破坏减轻了骨膜素驱动的氧化应激。然而，这种保护效应仅限于疾病早期阶段，在长期胆汁淤积损伤期间无法维持。结论：NQO1可作为情境依赖性调节因子，在PSC初始阶段加剧氧化应激和纤维化，提示靶向骨膜素-NQO1轴可能提供治疗益处。

引言

原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种慢性、进展性胆汁淤积性肝病，以持续性胆管炎症和胆道树纤维化重塑为特征。这些病理标志物不可避免地最终导致胆管肝硬化、门静脉高压和最终肝衰竭。尽管PSC被归类为罕见病，但其临床负担却是沉重的；它主要影响中青年人群，且通常需要肝移植。此外，PSC患者面临肝胆恶性肿瘤风险显著升高的问题，尤其是胆管癌，这是该群体死亡的主要原因之一。

尽管经过了数十年的密集临床和转化医学研究，PSC的确切病因和分子发病机制仍然难以捉摸。当前范式认为，PSC源于遗传易感性、免疫失调、环境因素和胆汁酸稳态紊乱之间的多方面相互作用。值得注意的是，与炎症性肠病的强临床关联——在60%-80%的病例中观察到——凸显了肠-肝轴介导的免疫反应在疾病进展中的潜在作用。然而，将慢性炎症与胆管损伤及进行性纤维化联系起来的特定信号通路尚未完全阐明。

越来越多的证据表明，氧化应激在PSC发病中起着关键作用。胆汁淤积条件促进疏水性胆汁酸和促炎细胞因子在肝内的积累，从而触发肝细胞和胆管细胞中活性氧（ROS）的过度产生。这种ROS的激增通过脂质过氧化和线粒体损伤引起细胞损伤，同时激活NF-κB和MAPK等纤维-炎症级联反应。此外，氧化应激促进胆管细胞凋亡、炎症细胞募集和肝星状细胞激活，这些都是胆管纤维化的关键驱动因素。

为抵御此类氧化损伤，细胞利用内源性抗氧化防御系统来维持氧化还原平衡。NAD(P)H：醌氧化还原酶1（NQO1）是一种关键的细胞保护酶，通过催化醌的两电子还原为氢醌来保护细胞，从而中和ROS并防止膜脂质过氧化。NQO1的表达主要受氧化应激时核因子红系2相关因子2（Nrf2）的调控，或在异生物作用下受芳烃受体（AhR）的调控。尽管NQO1已通过减轻ROS诱导的损伤在多种炎症性肝病中显示出保护作用，但其在PSC背景下的功能意义仍基本未被表征。

在本研究中，我们旨在探讨NQO1缺乏对PSC关键致病特征——包括凋亡、炎症和纤维化——的影响。此外，我们探索了潜在的分子机制，以确定NQO1相关信号是否在PSC发病中起关键调控节点作用。

方法

动物研究设计

本研究使用8-10周龄的雄性WT或NKO小鼠。为诱导PSC样表型，小鼠被饲喂补充0.1%（w/w）3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡咯（DDC；Sigma-Aldrich，美国MO州）的饮食或标准对照饮食，持续1周或3周。所有小鼠在SPF设施中于受控环境条件下（20-22°C，12小时光/暗周期）饲养，自由饮水和进食。所有动物实验均按照实验室动物饲养和使用机构指南进行，并经韩国生物科学与生物技术研究院实验动物护理和使用委员会批准（KRIBB-AEC-23065和KRIBB-AEC-24194）。动物实验按照ARRIVE指南报告。

血浆PSC生物标志物和总胆汁酸的测定

为分析PSC的生化指标，从小鼠采集血液样本并在4°C下以10,000g离心5分钟。将所得血浆分离并在-80°C下保存至后续使用。通过使用自动化学分析仪（Hitachi，日本东京）测定血浆中天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）和总胆红素（TBIL）水平来评估全身肝功能。此外，使用商业TBA试剂盒（Sigma-Aldrich）严格按照供应商指南量化DDC引起的总胆汁酸（TBA）浓度变化。简言之，将血浆与含有3α-羟类固醇脱氢酶和NAD的随附酶试剂在避光条件下孵育20分钟。使用微孔板读数仪在激发波长530 nm和发射波长585 nm处测量NADH依赖性反应产生的荧光。TBA浓度按照制造商的内部标准法计算。

公共人类PSC单细胞RNA测序分析

Andrews等人公开发布的人类PSC和非疾病肝脏scRNA-seq数据使用从CZ CELLxGENE Discover获取的已处理和注释数据集（集合ID：0c8a364b-97b5-4cc8-a593-23c38c6f0ac5；GEO GSE243981）进行了重新分析。使用Python中的Scanpy和AnnData进行分析。根据原始细胞类型注释识别肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞和巨噬细胞/库普弗细胞，并评估NQO1、NFE2L2（Nrf2）和AhR的表达。数据表示具有可检测转录本表达的细胞百分比（表达>0）。单独供体作为生物学重复。使用双侧Mann-Whitney U检验比较PSC和非疾病组，p<0.05被认为具有统计学显著性。

逆转录-定量PCR

按照制造商说明使用TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，美国MA州）从肝组织中提取总RNA。通过NanoDrop分光光度计（NanoDrop Technologies，德国）评估提取的RNA浓度和完整性。随后，使用UltraScript 2.0 cDNA合成试剂盒（PCR BioSystems，英国伦敦）将1 μg总RNA合成为cDNA。使用AccuPower 2× Greenstar qPCR主混液（Bioneer，韩国大田）在StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems，美国CA州）上进行定量PCR。使用2-ΔΔCt法确定相对mRNA表达水平，以18S rRNA作为内参。数据以相对于对照组的倍数变化呈现。引物序列的完整列表见表1。

表1 本研究中使用的引物列表

基因 | 正向引物 | 反向引物
---|---|---
NQO1 | 5′-gcccgcatgcagatcct-3′ | 5′-ggtctcctcccagacggttt-3′
AhR | 5′-gcaggatttgcaagaaggag-3′ | 5′-actgctgaaagcccaggtaa-3′
Nrf2 | 5′-ggccttttttgctcagtttca-3′ | 5′-atgtgggcaacctgggagta-3′
Catalase | 5′-cgaccagggcatcaaaaact-3′ | 5′-attggcgatggcattgaaa-3′
MnSod | 5′-ccacacattaacgcgcagat-3′ | 5′-tcggtggcgttgagattgt-3′
Gpx1 | 5′-tccgggactacaccgagatg-3′ | 5′-ttctcctggtgtccgaactga-3′
Prdx1 | 5′-acccaagaaacaaggagga-3′ | 5′-aaaaaggcccctgaaagaga-3′
Prdx2 | 5′-ggtgccttcaaggaaatcaa-3′ | 5′-gcctagctttcggaagtcct-3′
Prdx6 | 5′-aaacacccacggaaaagttg-3′ | 5′-ggcatgttgttagcgtcctt-3′
HO-1 | 5′-cagccccaccaagttcaaac-3′ | 5′-ggcggtcttagcctcttctgt-3′
F4/80 | 5′-gatgaattcccgtgttgttg-3′ | 5′-acatcagtgttccaggagac-3′
IL-1β | 5′-ctacaggctccgagatgaacaac-3′ | 5′-tccattgaggtggagagctttc-3′
IL-6 | 5′-tccatccagttgccttcttg-3′ | 5′-ttccacgatttcccagagaac-3′
TNFα | 5′-ccctcacactcagatcatcttct-3′ | 5′-gctacgacgtgggctacag-3′
TGF-β1 | 5′-gaggtcacccgcgtgcta-3′ | 5′-tgtgtgagatgtctttggttttctc-3′
α-SMA | 5′-catcaccaactgggacgaca-3′ | 5′-agaggcatagagggacagca-3′
Col1α1 | 5′-agcacgtctggtttggagag-3′ | 5′-gacattaggcgcaggaaggt-3′
Fibronectin | 5′-acacggtttcccattacgccat-3′ | 5′-aatgaccactgccaaagcccaa-3′
CD3 | 5′-tgccctctagacagtgacga-3′ | 5′-ttgaggctggtgtgtagcag-3′
IL-10 | 5′-gggttgccaagccttatcg-3′ | 5′-tctcacccagggaattcaaatg-3′
Col4α1 | 5′-attccttcgtgatgcacacc-3′ | 5′-gtgggcttcttgacatctc-3′
Bud13 | 5′-cagatgctggcttggaagga-3′ | 5′-cctccttttccggcttagca-3′
Mup11 | 5′-gctgctgtgtttgggactga-3′ | 5′-tcttttgtcagaggccaggat-3′
Mup14 | 5′-gctgaccctagtgtgttcc-3′ | 5′-tcttttgtcagaggccaggat-3′
Nudt7 | 5′-tttgatgttcacggtccgct-3′ | 5′-ggctgtgtcatctgtgtcca-3′
Postn | 5′-tgcgggaagaaaaccactgt-3′ | 5′-cccagcgtgccataaacatg-3′
18S rRNA | 5′-gacacggacaggattgacagattgatag-3′ | 5′-gttagcatgccagagtctcgttcgtt-3′

Western印迹分析

将肝组织在含蛋白酶抑制剂（Roche Applied Science，德国曼海姆）和磷酸酶抑制剂（Sigma-Aldrich）的放射免疫沉淀试验（RIPA）裂解液（Sigma-Aldrich）中匀浆。使用BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）定量蛋白产量。等量蛋白（20-40 μg）通过SDS-PAGE在8%-12%聚丙烯酰胺凝胶上分离，随后使用半干转移装置（Bio-Rad Laboratories，美国CA州）转移至硝酸纤维素膜上。在室温下使用含5%非脱脂奶粉的含Tween 20的tris缓冲盐溶液（TBST）封闭1小时后，在4°C下用抗NQO1（Abcam，美国MA州）、HO-1（Abcam）、α-SMA（Abcam）、纤维连接蛋白（Abcam）、Prdx1（Cell Signaling Technology，美国MA州）、Prdx2（Cell Signaling Technology）、Prdx6（MyBioSource，美国CA州）、过氧化氢酶（Cell Signaling Technology）、MnSOD1（BD Biosciences，美国CA州）、磷酸化-AKT（Ser473）和总AKT（Cell Signaling Technology）以及β-actin（Cell Signaling Technology）的一抗孵育过夜。用TBST洗涤3次后，与HRP偶联的二抗（1:2000）孵育1小时。使用增强化学发光（ECL）试剂检测蛋白免疫反应，并使用Ez-Capture数字成像系统（ATTO，日本东京）捕获图像。

肝卟啉水平的定量

为测定PSC小鼠模型中卟啉的积累，将肝组织在含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的冰冷0.25 M蔗糖溶液中匀浆。将所得匀浆液在4°C下以13,000 rpm离心10分钟，收集上清液用于进一步分析。使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。最初使用活体内成像系统（Lumina System；PerkinElmer，美国MA州）配合Cy5.5激发/发射滤光片在96孔黑色微孔板中检测上清液中的卟啉荧光强度。随后使用微孔板读数仪在激发波长405 nm和发射波长635 nm处进行定量。

组织病理学和免疫组织化学分析

将肝组织固定在10%中性缓冲福尔马林中，石蜡包埋并切成5 μm厚度的切片。切片在二甲苯中脱蜡，并通过递减乙醇梯度复水。进行形态学评估时，组织切片用苏木精-伊红（H&E）染色。使用基于Ishak标准的改良组织学活动指数（mHAI）评分系统评估组织学活动。对四项病理特征进行评分：界面性肝炎（0-4）、融合性坏死（0-6）、局灶性溶解坏死/凋亡伴局灶炎症活动（0-4）和门管区炎症（0-4）。将各项评分求和生成0至18的总体组织学活动评分。组织学评分由对实验分组分配不知情的病理学家完成。为评估炎症细胞浸润、氧化损伤和NQO1表达，组织切片在柠檬酸溶液中进行热诱导抗原修复15分钟，随后封闭1小时。切片在4°C下与抗F4/80（Cell Signaling Technology）、4-羟基壬烯醛（4-HNE；Abcam）或NQO1（Abcam）的一抗孵育过夜。用PBS洗涤3次后，使用Vectastain Elite ABC试剂盒（Vector Laboratories，美国CA州）进行二抗孵育。使用二氨基联苯胺（DAB；Vector Laboratories）可视化免疫反应，切片用抗荧光淬灭剂封片（Sigma-Aldrich）。为定量胆管纤维化，按照供应商方案使用商业染色试剂盒（Abcam）进行Masson三色染色。为检测凋亡细胞死亡，按照制造商说明使用原位细胞死亡检测试剂盒（Sigma-Aldrich）进行TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）试验。

转录组分析和生物信息学分析

从DDC给药1周后的NQO1 WT和KO小鼠肝脏中分离总RNA。简言之，使用poly T寡聚物偶联磁珠从总RNA池中提取mRNA，随后在二价阳离子存在下进行热片段化。使用随机六聚物合成第一链cDNA，而第二链合成中掺入dUTP进行链特异性标记。最终cDNA文库通过末端修复、加A尾、接头连接和PCR扩增序列构建。测序在Illumina X Ten平台上进行。使用R软件（版本4.5.1）对差异表达基因（DEGs）进行火山图、基因集富集分析（GSEA）和热图分析。对于热图可视化，根据RNA-seq数据集中提供的基因注释信息过滤基因。根据基因生物类型信息注释为假基因的基因被排除。此外，在生成热图前移除了符号以Gm、BC或Rik开头的基因。

细胞内NAD+和NADH水平的测定

使用商业NAD/NADH测定试剂盒（Abcam）定量肝脏NAD+含量。简言之，将肝提取物匀浆并在提取缓冲液中离心以获得清晰裂解液。为确保准确性，在酶学分析前通过10-kDa旋转柱（Abcam）过滤去除蛋白质。按照制造商方案测定游离NAD+和NADH的浓度。

原代肝细胞分离

按照既定方案并稍作调整后，从WT和NKO小鼠中分离原代肝细胞。简言之，安乐死小鼠后进行原位肝灌注。

中静脉通过24号导管插管，肝脏首先以27.5 mL/min的恒定流速灌注50 mL预温的EDTA缓冲液，以清除血液和细胞间连接。随后，肝脏以含4% I型胶原蛋白酶（Worthington, NJ, USA）和0.002% DNase I（Roche）的HBSS（Invitrogen）在37°C下消化，直至肝组织变软。小心切除消化后的肝脏，并在RPMI培养基中破坏包膜以释放肝细胞。所得细胞悬液经70 μm尼龙细胞滤器过滤，并在4°C下以50g离心5分钟。为纯化活肝细胞，将Percoll、10× PBS和HEPES按45:5:0.5（v/v/v）比例混合制备等渗Percoll梯度。离心后，从管底收集含活肝细胞的沉淀物，用RPMI培养基洗涤，并进行后续培养处理。

细胞培养、NQO1敲低及体外实验

将HepG2（人肝细胞癌）、LX-2（人肝星状细胞）和原代肝细胞培养于含10%胎牛血清的Dulbecco改良鹰氏培养基（HyClone GE Healthcare Life Sciences, UT, USA）中，在37°C、5% CO2环境中培养。当6孔板中的细胞达到70%汇合度时，将细胞饥饿过夜，随后以100 ng/mL重组骨膜蛋白（Sino Biological, 北京，中国）刺激指定时长。将HepG2细胞暴露于牛磺胆酸（TCA, 100 μM, Sigma-Aldrich）、TGF-β1（10 ng/mL; Sigma-Aldrich）或TNF-α（10 ng/mL; PeproTech, NJ, USA）24小时。随后用冰冷的PBS冲洗细胞，用十二烷基硫酸钠上样缓冲液裂解，用于后续蛋白分析。对于抑制实验，将HepG2细胞接种于6孔板中培养24小时。细胞饥饿过夜后，分别用BAY 11-7082（10 μM, Sigma-Aldrich）、LY294002（10 μM, Sigma-Aldrich）、PF-573228（5 μM, Selleck Chemicals）或N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC; 5 mM, Sigma-Aldrich）预处理45分钟，再进行骨膜蛋白或胰岛素（100 nM, Sigma-Aldrich）处理。

RNA干扰敲低NQO1

为实现NQO1的瞬时沉默，将HepG2和LX-2细胞接种于6孔板中并培养至50%汇合度。使用20 nM NQO1特异性siRNA或非靶向随机siRNA（Bioneer）进行转染。转染通过Lipofectamine RNAiMAX试剂（Invitrogen）按照制造商方案进行。特异性siRNA序列为5'-AAACCAGCCUUUCAGAAUGGCUGGC-3'（正义链）和5'-GCCAGCCAUUCUGAAAGGCUGGUUU-3'（反义链）。细胞继续培养至70%汇合度，随后测量细胞内ROS水平。为探究NQO1在TGF-β信号中的作用，将LX-2细胞转染随机siRNA或NQO1靶向siRNA。转染后，用TGF-β1刺激细胞指示时长。

ROS测量

使用2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA）荧光探针评估细胞内ROS生成。将HepG2和原代肝细胞用重组骨膜蛋白处理6小时后，用DCF-DA孵育以量化氧化应激反应。

统计分析

定量数据以均值±标准误（SEM）表示。使用ImageJ软件（版本1.53t）量化阳性细胞面积和细胞计数。两组实验组之间的统计比较使用GraphPad Prism软件（版本8.0; Northampton, MA, USA）进行非配对Student t检验。对于两组独立实验组的比较，采用非配对双尾Student t检验。当在同一实验条件下比较两种基因型之间多个同时比较的个体基因时，应用带Holm-?ídák多重比较校正的多次非配对t检验。对于涉及基因型和饮食作为自变量的实验，数据采用双因素方差分析（ANOVA）进行分析，随后对相关事后比较采用?ídák多重比较检验。双侧p值<0.05被认为具有统计学显著性。

结果

DDC诱导的胆汁损伤可强烈诱导肝脏NQO1表达

为研究胆汁淤积条件下NQO1的表达谱，小鼠喂食含DDC的饮食1周。PSC模型成功建立，证据包括：DDC喂养小鼠的肝损伤标志物（AST、ALT、ALP和T-bil）系统性升高，组织学上出现代表性的导管反应，以及DDC喂养小鼠与CD喂养小鼠相比mHAI评分显著增加（图1A、B）。在这些病理条件下，我们观察到NQO1在mRNA和蛋白水平均显著上调（图1C、D）。免疫组化分析进一步显示，与CD喂养小鼠相比，DDC喂养小鼠的肝细胞中NQO1蛋白表达增加（图1E）。该诱导伴随着NQO1主要上游调节因子Nrf2和AhR水平升高，表明NQO1是DDC诱导损伤中的关键应激应答元件（图1F）。为评估转化意义，我们重新分析了可用的PSC患者人肝scRNA-seq数据。NQO1表达在肝细胞中显著增加，在HSC和Kupffer细胞中呈不显著上升趋势（图1G）。Nrf2在所有检测的细胞类型中均显著升高，而AhR在胆管细胞、HSC和Kupffer细胞中增加（图1H、I）。这些发现表明，PSC与以细胞类型依赖方式增强的NQO1相关应激应答有关。

开放多媒体窗口

图1 图1 开放多媒体窗口：DDC喂养的PSC小鼠模型中NQO1诱导的特征描述。（A）维持于CD（n=5）或DDC饮食（n=5）的小鼠中肝损伤指标（AST、ALT、ALP和T-bil）的量化。（B）CD（n=5）和DDC（n=5）组小鼠的代表性H&E染色肝组织切片及使用改良组织活动指数（mHAI）的组织学损伤定量评估。来自单只小鼠用于mHAI评估的额外H&E染色视野见补充图S1，https://links.lww.com/HC9/C508。比例尺：200 μm。（C）肝脏Nqo1 mRNA表达水平的RT-qPCR分析（CD, n=5; DDC, n=6）。（D）Western blot分析显示NQO1和HO-1的蛋白水平，以β-actin作为内参（左）。以β-actin标准化的NQO1和HO-1蛋白水平的灰度定量以柱状图显示（右）。（E）肝脏切片的免疫组化染色代表性图像，使用抗NQO1抗体确定NQO1的空间分布。比例尺：200 μm。（F）通过RT-qPCR测量的NQO1上游调节因子——芳烃受体（AhR）和核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）的转录水平（CD, n=5; DDC, n=6）。（G–I）重新分析健康个体和PSC患者的公开人肝scRNA-seq数据。比较健康肝脏与PSC肝脏中肝细胞、胆管细胞、HSC和Kupffer细胞中可检测到转录本的细胞百分比：（G）Nqo1、（H）Nrf2和（I）AhR；*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。缩写：AhR，芳烃受体；ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天门冬氨酸氨基转移酶；CD，对照饮食；DDC，3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡咯；H&E，苏木精和伊红；HO-1，血红素加氧酶1；HSCs，肝星状细胞；mHAI，改良组织活动指数；NQO1，NAD(P)H醌氧化还原酶1；Nrf2，核因子红细胞2相关因子2；PSC，原发性硬化性胆管炎；RT-qPCR，逆转录-定量PCR；scRNA-seq，单细胞RNA测序；T-bil，总胆红素。

NQO1缺陷触发独立于NAD+代谢的补偿性抗氧化防御

为研究NQO1在胆汁淤积性肝损伤期间肝脏抗氧化反应中的贡献，将WT和NKO小鼠喂食对照饮食（CD）或DDC饮食7天。DDC喂养显著改变了肝脏多种抗氧化基因的表达，包括过氧化氢酶、MnSOD、Gpx、Prdx1、Prdx2、Prdx6和HO-1。值得注意的是，DDC喂养NKO小鼠这些基因的转录水平显著低于其WT对照（图2A）。在蛋白水平，DDC给药后Prdx1表达保持不变，而Prdx2、Prdx6、MnSOD和过氧化氢酶在两种基因型中均呈下降趋势（图2B）。在这些蛋白中，DDC喂养条件下NKO小鼠的过氧化氢酶低于WT小鼠（图2B）。分离的原代肝细胞中的抗氧化蛋白谱与全肝裂解液中观察到的部分不同（图2C）。Prdx1和Prdx2水平在WT-CD和WT-DDC来源的肝细胞中相当，而Prdx6、MnSOD和过氧化氢酶在DDC处理后降低。此外，两种条件下NKO肝细胞中的MnSOD表达均高于WT肝细胞（图2C）。这些差异表明，非实质细胞或肝微环境因素可能有助于全肝观察到的抗氧化反应。DDC显著增加肝脏4-HNE积累，而NKO小鼠中这种增加显著减少，表明尽管抗氧化谱发生改变，但NQO1缺陷减轻了DDC诱导的脂质过氧化（图2D）。尽管两种基因型中肝脏NAD+和NADH水平在DDC治疗后均呈下降趋势，但与相应CD组相比差异无统计学显著性。此外，在任何饮食条件下均未观察到基因型依赖性差异（图2E）。这些结果表明，尽管多种抗氧化基因和蛋白表达降低，但NQO1缺陷减轻了DDC诱导的肝脏脂质过氧化，而不显著影响肝脏NAD+和NADH水平。

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图2 图2 开放多媒体窗口：NQO1缺陷对抗氧化防御和氧化应激的影响。（A）DDC处理的WT（n=6）和NKO（n=5）肝脏中抗氧化相关基因转录本的比较；*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。（B）左侧为CD或DDC挑战条件下WT和NKO小鼠肝脏抗氧化蛋白表达的代表性免疫印迹图（每组n=2）。右侧使用ImageJ软件对相应蛋白条带进行灰度定量。该实验独立重复两次。（C）左侧为实验流程示意图。WT和NKO小鼠分别喂食CD或DDC 7天。随后分离原代肝细胞，接种并在细胞贴壁后立即收集用于蛋白提取。中间为分离的原代肝细胞中抗氧化蛋白表达的代表性免疫印迹图，右侧为相应蛋白条带的灰度定量。（D）脂质过氧化标志物4-HNE的免疫组化检测和基于ImageJ的定量。比例尺：200 μm。（E）所有实验组（每组n=5）中肝脏NAD+和NADH水平的测定。缩写：4-HNE，4-羟基壬烯醛；CD，对照饮食；DDC，3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢吡咯；NAD+，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化型）；NADH，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NKO，NQO1基因敲除；NQO1，NAD(P)H:醌氧化还原酶1；NS，无显著性差异；WT，野生型。

NQO1缺失赋予对急性胆汁淤积性肝损伤的保护作用

为确定NQO1缺陷的急性效应，将WT和NKO小鼠分别喂食CD或含DDC的饮食1周。随后评估肝损伤的血浆标志物。在DDC喂养小鼠中，两种基因型之间AST和ALP无显著差异（图3A、C）。相反，NKO小鼠的血浆ALT水平显著低于WT小鼠，而总胆红素水平在NKO组呈下降趋势（图3B、D）。H&E染色的组织学检查显示NKO小鼠肝损伤减轻，NKO-DDC小鼠与WT-DDC小鼠相比mHAI评分显著降低（图3E）。尽管与NQO1的广泛诱导相比，TUNEL阳性肝细胞较为罕见，但NKO-DDC小鼠中TUNEL阳性细胞的频率显著低于WT-DDC小鼠（图3F）。值得注意的是，卟啉和TBA的积累在两组间保持不变，表明NQO1缺陷通过独立于胆汁酸水平或卟啉清除的机制保护肝脏（图3G、H）。

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图3 图3 开放多媒体窗口：NKO小鼠中DDC诱导的肝胆损伤的减轻。为确定NQO1缺陷是否保护急性胆汁淤积性肝损伤，将WT和NKO小鼠分别喂食CD或DDC 7天。（A–D）分析WT和NKO组血浆AST、ALT、ALP和总胆红素（T-bil）水平以评估肝功能；*p<0.05。（E）H&E染色肝组织切片的代表性图像和mHAI评分，展示DDC诱导的病理变化。来自单只小鼠用于mHAI评估的额外H&E染色视野见补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C508。比例尺，200 μm；*p<0.05。（F）TUNEL染色肝组织切片的代表性图像及使用ImageJ软件对TUNEL阳性细胞的定量。柱状图显示总TUNEL阳性细胞百分比和TUNEL阳性肝细胞百分比，均以所分析显微视野内细胞总数计算；***p<0.001。（G）基于IVIS的卟啉积累可视化及随后使用VICTOR多功能酶标仪的RFU测量。（H）肝脏组织中TBA浓度的测定。所有实验组均包含5只小鼠（每组n=5）。

**缩写：** ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸氨基转移酶；CD，对照饮食；DDC，3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢高莱因；H&E，苏木精-伊红染色；IVIS，活体成像系统；mHAI，改良组织学活动指数；NKO，NQO1基因敲除；NQO1，NAD(P)H醌氧化还原酶1；RFU，相对荧光单位；TBA，总胆汁酸；T-bil，总胆红素；TUNEL，TdT介导的dUTP缺口末端标记；WT，野生型

**尽管存在持续炎症，NKO小鼠的肝纤维化仍表现出选择性减弱**

接下来，我们评估了NQO1缺失对炎症和纤维化的影响，这两者是PSC的标志性病理特征。我们进行了F4/80免疫组化染色以评估炎症细胞浸润情况。F4/80阳性巨噬细胞的定量结果显示，与WT小鼠相比，NKO小鼠肝脏中的巨噬细胞数量有所减少（图4A）。尽管有这种减少，两组之间促炎细胞因子Il-1β、Il-6和TNFα的肝脏mRNA水平无显著差异（图4B）。相比之下，NKO小鼠的肝纤维化显著减轻。Masson染色显示，与WT小鼠相比，NKO小鼠的胶原沉积显著降低（图4C）。这种组织学改善伴随着促纤维化基因（如Tgf-β1、Tgf-β2、Col1α1和Fibronectin）的显著下调（图4D）。与这些转录组变化相印证，DDC喂养的NKO肝脏中纤维连接蛋白和α-SMA的蛋白水平也明显降低（图4E）。综合而言，这些结果表明NQO1特异性地促进了DDC诱导的肝纤维化，而与初始炎症反应无关。

**开放多媒体模式 图4 开放多媒体模式**

**NQO1缺失对急性DDC暴露后肝脏炎症和纤维化反应的影响。** 为评估NQO1缺失是否改变肝脏炎症和早期纤维化反应，WT和NKO小鼠分别喂养CD（n=5）或DDC（n=6）饮食7天。（A）F4/80免疫组化染色的肝脏切片代表性图像，显示肝脏巨噬细胞浸润（上），并附有F4/80阳性面积占总组织面积的百分比量化（下）。比例尺，200 μm；**p<0.01。（B）代表性促炎细胞因子和炎症标志物肝脏mRNA表达水平的RT-qPCR分析。（C）Masson三色染色的肝脏切片代表性图像，显示胶原沉积，并附有三色阳性面积占总组织面积的百分比量化。比例尺，100 μm；**p<0.01。（D）纤维化相关转录因子的RT-qPCR定量：TGF-β1、α-SMA、Col1α1和纤维连接蛋白；*p<0.05或***p<0.001。（E）纤维化标志物（纤维连接蛋白和α-SMA）的代表性免疫印迹，以GAPDH作为上样对照。使用ImageJ软件对条带强度进行定量，并以柱状图呈现。本实验独立重复两次。**缩写：** α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；CD，对照饮食；Col1α1，I型胶原蛋白α1链；DDC，3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢高莱因；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；mRNA，信使RNA；NKO，NQO1基因敲除；NQO1，NAD(P)H:醌氧化还原酶1；RT-qPCR，逆转录定量PCR；TGF-β1，转化生长因子β1；WT，野生型

**转录组图谱揭示NQO1依赖性调节EMT和纤维化通路**

为进一步阐明NQO1缺失调节PSC发病机制的分子机制，我们对WT和NKO肝脏组织进行了比较RNA测序（RNA-seq）。转录组分析鉴定出NKO小鼠中有101个差异表达基因（DEGs），包括43个上调基因和58个下调基因（图5A）。差异表达程度最高的前20个基因的热图显示Abca3、Fam213b、Nudt7、Cyp2a22、Mup14和Mup11被诱导表达，而Nqo1、Cd300ld、Postn、Lgals1和Inmt被抑制（图5B）。在差异表达基因中，几个基因通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）得到了验证，其表达模式与RNA-seq数据一致（图5C）。基因集富集分析（GSEA）为NQO1消融驱动的功能性转变提供了更深入的见解。我们观察到NKO小鼠中参与"胆汁酸代谢"、"氧化磷酸化"和"异生物质代谢"的基因集呈正向富集。相反，与疾病进展密切相关的通路，如"EMT"、"G2M检查点"和"TNFα通过NF-κB的信号传导"，则呈下调趋势（图5D、E）。这些特征强调了NQO1在慢性肝损伤过程中编排促纤维化信号传导的关键作用。

**开放多媒体模式 图5 开放多媒体模式**

**DDC给药后WT和NKO肝脏的转录组分析。** 为表征NQO1缺失在胆汁淤积条件下对肝脏基因表达的影响，使用DDC喂养的WT（n=3）和NKO（n=3）小鼠的肝脏组织进行RNA测序。（A）火山图展示WT和NKO肝脏之间差异表达基因（DEGs）的分布。（B）两组之间表达差异大于2倍的差异表达基因的聚类热图。（C）通过RT-qPCR验证多个在RNA-seq数据集中鉴定为差异表达的基因，包括Bud13、Mup11、Mup14、Nudt7、Nqo1和Postn；*p<0.05或***p<0.001。（D）在NKO-DDC组中显著富集的生物学通路的GSEA图。（E）DDC挑战后与WT小鼠相比NKO小鼠中下调通路的GSEA图。**缩写：** DEGs，差异表达基因；GSEA，基因集富集分析；NKO，NQO1基因敲除；NQO1，NAD(P)H:醌氧化还原酶1；RNA-seq，RNA测序；RT-qPCR，逆转录定量PCR；WT，野生型

**骨膜蛋白诱导的NQO1蛋白表达驱动肝细胞氧化应激**

我们的差异表达基因分析鉴定出Postn（骨膜蛋白）存在显著调控，骨膜蛋白是已知的组织纤维化驱动因子。2? 为探讨骨膜蛋白与NQO1之间的功能联系，我们使用重组骨膜蛋白处理HepG2细胞、LX-2细胞和原代肝细胞。Western blot分析显示，所有细胞类型中NQO1蛋白水平均随时间依赖性上调（图6A）。已知骨膜蛋白可激活多条信号通路，包括FAK1、NF-κB和PKB/AKT。21 为确定骨膜蛋白诱导NQO1蛋白表达的机制，我们进行了药理学抑制实验。有趣的是，骨膜蛋白诱导的NQO1蛋白水平被BAY 11-7082和NAC减弱，提示氧化还原敏感信号通路参与了这一反应（图6B）。为确认抑制剂活性，我们检测了AKT磷酸化——PI3K和FAK1信号传导的下游靶标。尽管骨膜蛋白未诱导AKT磷酸化，但LY294002和PF-573228均抑制了基线AKT磷酸化，证实了它们在我们的实验条件下具有活性（图6C）。NQO1蛋白表达未受TCA、TGF-β1或TNFα等其他病理刺激的影响，表明骨膜蛋白-NQO1轴具有特异性（图6D）。功能学实验进一步证明，骨膜蛋白挑战显著提高了HepG2细胞和原代肝细胞中的ROS产生。关键的是，这种氧化应激飙升可被siRNA介导的Nqo1敲低或基因敲除有效中和（图6E）。为进一步阐明NQO1缺失对抗氧化防御系统的影响，我们检测了之前在DDC处理的肝脏中发现发生变化的各种抗氧化酶的表达。在HepG2细胞中，siRNA介导的Nqo1敲低可显著增加MnSOD的表达，无论是否进行骨膜蛋白处理，但其他抗氧化蛋白与体内数据的相关性有限（图6F）。相反，来自NKO小鼠的原代肝细胞表现出与DDC损伤肝脏一致的蛋白图谱，其特征为Prdx1、Prdx6和MnSOD水平升高（图6G）。这些结果表明，虽然NQO1缺失触发了代偿性抗氧化反应，但如同体内观察到的那样全面且稳定的防御上调可能依赖于NQO1的持续丧失而非暂时性降低。

**开放多媒体模式 图6 开放多媒体模式**

**骨膜蛋白诱导的NQO1表达及其在调节细胞ROS反应中的作用。** 为研究骨膜蛋白介导的NQO1诱导背后的信号机制以及NQO1对氧化应激的贡献，我们在体外检测了NQO1表达和抗氧化反应。（A）重组骨膜蛋白（100 ng/mL）处理后，HepG2、LX-2和原代肝细胞中NQO1随时间依赖性表达的代表性免疫印迹。相应的NQO1条带以图表形式呈现。本实验独立重复两次。（B）为确定骨膜蛋白诱导NQO1表达的参与信号通路，细胞在骨膜蛋白刺激前分别用BAY 11-7082（10 μM）、LY294002（10 μM）、PF-573228（5 μM）或NAC（5 mM）预处理。通过免疫印迹测定NQO1蛋白水平。本实验独立重复两次。（C）用BAY 11-7082、LY294002或PF-573228预处理并进行骨膜蛋白刺激后，磷酸化AKT和总AKT的免疫印迹分析。胰岛素作为AKT磷酸化的阳性对照。本实验独立重复两次。（D）用牛磺胆酸（TCA；100 μM）、TGFβ1（10 ng/mL）或TNF-α（10 ng/mL）处理24小时后NQO1表达的免疫印迹分析。（E）骨膜蛋白刺激的HepG2和原代肝细胞的荧光DCF-DA成像。比例尺：100 μm。（F、G）在siRNA介导的NQO1敲低和基因敲除后，评估骨膜蛋白应答后抗氧化酶的变化。本实验独立重复两次。**缩写：** DCF-DA，2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯；FAK1，黏着斑激酶1；HepG2，人肝细胞癌细胞系；NAC，N-乙酰-L-半胱氨酸；NQO1，NAD(P)H:醌氧化还原酶1；ROS，活性氧；siRNA，小干扰RNA；TCA，牛磺胆酸；TGF-β1，转化生长因子β1；TNF-α，肿瘤坏死因子α

**NQO1-骨膜蛋白轴选择性调节PSC进展的早期阶段**

为进一步厘清NQO1在持续胆汁淤积损伤过程中的功能性贡献，我们评估了DDC喂养3周后NQO1缺失的影响。DDC喂养显著升高了血浆肝损伤生化标志物水平；然而，WT和NKO组之间未观察到显著差异（图7A）。包括H&E和Masson三色染色在内的组织病理学评估显示，两种基因型的小鼠胆管反应和胶原沉积程度相当，提示NQO1缺失并未加重慢性期纤维化（图7B）。此外，RT-qPCR分析显示，NQO1介导的促纤维化基因抑制作用（在急性模型中明显存在）在长期DDC给药后被消除（图7C）。为探讨可能导致NQO1缺失相关早期保护表型丧失的潜在机制，我们用TGF-β1以时间依赖性方式处理转染了scrambled siRNA或siNQO1的LX-2细胞（图7D）。有趣的是，与对照细胞相比，NQO1敲低细胞中TGF-β1刺激的Smad2磷酸化更强且持续时间更长（图7D）。这些发现提出了一个可能性，即TGF-β/Smad2信号传导的改变可能有助于在持续胆汁淤积损伤过程中NQO1缺失相关早期保护表型的丧失。

**开放多媒体模式 图7 开放多媒体模式**

**NQO1缺失在DDC喂养PSC小鼠模型中的长期效应。** 为评估持续NQO1缺失在慢性胆汁淤积性肝损伤中的作用，WT和NKO小鼠分别维持CD（n=5）或DDC（n=6）饮食3周。（A）量化血浆AST、ALT、ALP和T-bil水平以评估肝胆损伤。（B）通过H&E和Masson三色染色对两组肝脏进行组织病理学评估。Masson三色阳性面积以占肝脏切面总面积的百分比量化，并将DDC喂养的WT和NKO组结果以柱状图呈现。比例尺：200 μm（H&E）或100 μm（Masson三色）。（C）指定基因肝脏mRNA表达水平的RT-qPCR分析。（D）LX-2细胞转染scrambled siRNA或靶向NQO1的siRNA后，用TGF-β1刺激指定时间段。代表性免疫印迹显示磷酸化Smad2和总Smad2的水平，以β-actin作为上样对照。相应蛋白条带的灰度定量以伴随的图表形式呈现。本实验独立重复两次。**缩写：** ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸氨基转移酶；CD，对照饮食；DDC，3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢高莱因；H&E，苏木精-伊红染色；mRNA，信使RNA；NKO，NQO1基因敲除；NQO1，NAD(P)H:醌氧化还原酶1；RT-qPCR，逆转录定量PCR；siRNA，小干扰RNA；T-bil，总胆红素；TGF-β1，转化生长因子β1；WT，野生型

**讨论**

本研究阐明了NQO1在PSC发病机制中复杂且具有阶段特异性的作用。传统上，NQO1被誉为II相抗氧化反应的基石，主要在Nrf2通路的转录调控下发挥作用。12 其经典生化作用涉及将醌进行两电子还原为稳定的氢醌，这一过程可防止高度活泼的半醌中间体形成及随后的超氧自由基生成。22 此外，已知NQO1可维持细胞内的NAD?/NADH比值，并保护p53和PGC-1等关键蛋白免受蛋白酶体降解。23 鉴于其广泛的保护功能，NQO1的上调通常被解释为减轻氧化损伤的代偿性机制。然而，我们的研究结果表明，在胆汁损伤的背景下，NQO1可能发挥更为复杂的作用。在DDC诱导损伤的急性期，NKO小鼠表现出显著较低的 plasma ALT水平和较少的TUNEL阳性肝细胞，而AST、ALP和总胆红素水平在两种基因型之间无显著差异。这些发现提示NQO1缺失可能对急性胆汁淤积性肝损伤提供部分保护作用，尽管其潜在机制及在持续损伤过程中的相关性仍有待进一步确立。

NKO小鼠对DDC诱导损伤的抵抗力似乎源于肝脏抗氧化网络的强健代偿性重新整合。

在NQO1缺失的情况下，我们观察到Prdx1和MnSOD水平出现基线升高及应激诱导性升高，这种升高具体发生在肝细胞内。这种过氧化物还原酶和超氧化物歧化酶系统在局部区域的增强，很可能为对抗脂质过氧化提供了更具针对性的防御，正如NQO1敲除小鼠肝脏中4-HNE阳性细胞明显减少所证实的那样。有趣的是，尽管NQO1通常通过NAD+代谢与线粒体生物能量学相关联，24但我们的数据显示各基因型的核苷酸水平相当，这表明NQO1敲除小鼠获得的保护作用主要是由更优越的ROS清除能力驱动的，而非系统性的代谢改变。这凸显了肝脏氧化还原稳态中存在高度的功能冗余性和可塑性，即一种主要抗氧化酶的缺失会触发一种更为有效的替代防御机制。25

本研究的一项重要机制性发现是，将骨膜蛋白–NQO1轴表征为氧化应激的特异性驱动因素。骨膜蛋白是一种基质细胞外蛋白，已知其在慢性炎症疾病中的上皮下纤维化和组织重塑中发挥作用，26是肝脏NQO1的强效诱导剂。虽然促纤维化或促炎刺激物（如TGF-β和TNF-α）对NQO1蛋白表达几乎没有影响，但骨膜蛋白处理直接触发了依赖性NQO1的氧化激增。发现NQO1沉默或基因缺失可能在特定的病理条件下促成氧化应激，尽管相关的氧化还原底物和机制仍不清楚。重要的是，NQO1的作用具有底物依赖性：甲基萘醌通常通过NQO1介导的两电子还原被解毒，而β-拉帕酮则可发生依赖NQO1的无效氧化还原循环。27–29在胆汁淤积性肝损伤中，胆汁酸水平改变、氧化应激和线粒体功能障碍可能进一步改变依赖NQO1的氧化还原效应。30,31因此，我们的发现并未将NQO1确立为一种普遍的促氧化因素，而是提示其作用取决于现存底物和细胞氧化还原环境。这或许也能解释我们先前研究中的表观差异，在该研究中β-拉帕酮通过NAD相关的代谢变化和Abcb4诱导减轻了PSC的发病，而在Mdr2/Abcb4缺陷小鼠中这种保护作用消失。19因此，不应假定药理学β-拉帕酮治疗能重现遗传性NQO1缺失的效果或DDC诱导胆汁淤积损伤期间内源性NQO1活性的作用。

在急性DDC诱导的损伤过程中，NKO小鼠表现出胶原沉积显著减少以及核心促纤维化基因（包括Col1α1、纤维连接蛋白和TGF-β1）的下调。我们的RNA-seq数据进一步印证了这一发现，显示NKO肝脏中与EMT及通过NF-κB介导的TNFα信号通路相关的基因集呈负向富集。这些结果提示NQO1与DDC诱导损伤早期阶段的促纤维化信号通路之间存在一定的关联。值得注意的是，与NQO1缺失相关的早期保护表型在DDC给药3周后不再明显，此时野生型和NKO小鼠表现出相当的生化损伤标志物、胶原沉积和促纤维化基因表达。这些发现表明，NQO1缺失的后果会随胆汁淤积性损伤的持续时间和病理背景而有所不同。导致这种时间差异的一种可能机制涉及TGF-β/Smad信号通路的改变。持续的TGF-β信号可抑制HSC中的Nrf2/NQO1抗氧化程序，因为TGF-β1通过Smad依赖的机制降低Nrf2和NQO1的表达。32相反，Nrf2抗氧化通路的激活伴随NQO1的诱导，可减弱HSC和实验性肝纤维化中的TGF-β/Smad信号和促纤维化反应。33直接过表达NQO1也被证明可抑制实验性纤维化疾病模型中的TGF-β/Smad激活和细胞外基质积聚。34与这些先前研究一致，我们的体外结果显示NQO1缺失导致TGF-β/Smad2信号的持续存在。这种相互的串扰可能部分解释了为何急性DDC暴露中观察到的NQO1缺失保护作用在慢性暴露期间减弱或逆转。

本研究的若干局限性值得考虑。首先，尽管我们的数据证实了依赖NQO1的氧化应激，但在胆汁淤积条件下触发ROS生成的内源性底物身份仍不清楚。鉴定胆汁酸代谢物、氧化儿茶酚胺或泛醌衍生物是否通过NQO1发生无效氧化还原循环，将需要全面的代谢组学分析。27此外，从早期NQO1介导的损伤向由多种因素驱动的慢性纤维化阶段的机制转变仍需进一步研究。最后，体内实验仅限于雄性小鼠，这一选择的合理性在于男性PSC发病率较高以及雌激素的肝脏保护作用。35–37然而，这一选择限制了研究结果的普适性。由于性别会影响Nrf2通路、抗氧化防御以及氧化应激易感性，骨膜蛋白–NQO1轴在雌性中的功能可能存在差异。纳入雌雄两性的后续研究对于阐明潜在的性别二态性并确保更广泛的临床相关性至关重要。

总之，我们的研究揭示了NQO1在胆汁淤积性肝损伤中阶段依赖性和背景特异性的作用。在急性DDC暴露期间，NQO1缺失与ALT水平、脂质过氧化和促纤维化反应降低相关。然而，在长期DDC诱导的损伤过程中，这些早期保护作用并不明显，野生型和NKO小鼠表现出相当的纤维化反应。综合来看，我们的发现表明NQO1的生物学后果取决于疾病阶段、底物可获得性和细胞氧化还原环境，在评估NQO1作为胆汁淤积性肝病潜在治疗靶点时应考虑这些因素。