克隆性区域聚集传播而非垂直传播：全基因组流行病学揭示芬兰肉鸡氟喹诺酮耐药空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）阶段性激增的驱动机制

《Acta Veterinaria Scandinavica》：Clonal, regionally clustered spread—rather than vertical transmission—explains surges in fluoroquinolone?resistant Campylobacter jejuni in Finnish broilers

　　

背景：空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是主要的人兽共患食源性病原体，家禽被认为是人感染的重要储存库。尽管芬兰肉鸡生产中的抗菌药物使用量很低，但仍检测到氟喹诺酮类和四环素（tetracycline，TET）耐药C. jejuni的散发性增加。研究人员调查了芬兰家禽生产中C. jejuni的种群结构、抗菌药物耐药性和传播途径。结果：研究人员对2014—2019年从种鸡群（breeder flocks；n = 145）和肉鸡群（broiler flocks；n = 188）收集的333株C. jejuni分离株，采用全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）、抗菌药物耐药性谱分析、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、核心基因组MLST（core-genome MLST，cgMLST）和系统发育基因组学分析（phylogenomic analysis）进行了表征。对氟喹诺酮类（fluoroquinolones）和TET的耐药性集中在特定年份，并与特定谱系尤其是ST-206克隆复合体（clonal complex，CC）密切相关，而占优势的ST-45 CC大多敏感。基因组聚类识别出若干耐药克隆在地理邻近的肉鸡养殖场之间循环，提示区域水平传播。来自种鸡的耐药分离株不常见，且无基因组证据支持耐药菌株从种鸡群向肉鸡群垂直传播。相反，耐药性峰值主要归因于成功耐药谱系的克隆扩增（clonal expansion）。结论：芬兰肉鸡生产中氟喹诺酮类和TET耐药C. jejuni的阶段性增加主要由区域克隆性水平传播驱动，而非由种鸡向肉鸡的垂直传播驱动。这些发现凸显了基因组监测在检测和追踪抗菌药物耐药弯曲菌谱系方面的价值，并支持将分子流行病学（molecular epidemiology）整合入家禽监测和控制规划。

研究背景与问题：空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是全球食源性人兽共患胃肠炎的主要病原之一，家禽被认为是人感染的重要储存库。芬兰肉鸡生产抗菌药物使用量低，但2014—2019年部分年份出现氟喹诺酮类和四环素（tetracycline，TET）耐药C. jejuni的散发性升高；种鸡群在2010年后未用抗菌药物，肉鸡生产链自2007年以来未使用喹诺酮类，因此耐药克隆的来源及传播路径不清。研究人员据此分析芬兰种鸡（breeder）和肉鸡（broiler）群C. jejuni的种群结构、抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance，AMR）和传播途径，评估克隆传播及潜在垂直传播对耐药阶段性升高的贡献。研究分析333株C. jejuni（种鸡145株、肉鸡188株），结合全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）与生产链流行病学信息，结论是芬兰肉鸡氟喹诺酮和TET耐药阶段性升高主要由区域克隆性水平传播而非种鸡到肉鸡垂直传播驱动，耐药与特定谱系尤其ST-206克隆复合体（clonal complex，CC）相关；这凸显基因组监测和将分子流行病学整合入家禽监测控制规划的价值。

关键技术方法（不超过250字）：样本队列来源于2014—2019年芬兰屠宰期种鸡群（145株，37个农场，覆盖全部阳性种鸡群）和肉鸡群（188株，89个农场；来自国家控制与耐药监测计划，2014年64株、2015—2019年125株）。研究人员对333株进行Illumina WGS，经INNUca流程质控组装；用Staramr比对ResFinder和PointFinder数据库预测耐药基因和突变；用多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和基于chewBBACA的自建核心基因组MLST（core-genome MLST，cgMLST；3,728个位点，1,292个核心位点）进行分型、聚类和最小生成树分析；用Prokka、Roary和IQ-TREE（GTR+I+G）构建系统发育基因组树；结合屠宰批次、农场地址和种鸡—肉鸡追溯信息及Haversine公式计算农场距离。

研究结果：
（1）种鸡与肉鸡分离株的多位点序列分型（MLST）：通过WGS和MLST分析333株分离株，发现15个CC和95个序列型（sequence type，ST），其中61个ST（64.2%）仅由单株代表。种鸡和肉鸡均以ST-45 CC为主（种鸡74/145，51.0%；肉鸡82/188，43.6%），ST-45为最优势ST（种鸡45/145，31.0%；肉鸡42/188，22.3%）。种鸡其他主要ST为ST-11、ST-230和ST-677；肉鸡中ST-677、ST-945、ST-1326和ST-383跨数年出现；肉鸡ST-21 CC为14/188（7.4%）、ST-206 CC为31/188（16.5%），仅在一至两年出现；种鸡中未见ST-21 CC。14个ST同时见于种鸡和肉鸡，但同ST多来自不同农场；2017年ST-2197为例外，见于同一农户的种鸡和肉鸡分离株。结论：种群以少数优势谱系为主并伴多样散在ST，种鸡与肉鸡总体呈混合种群但生产分离明显。

（2）种鸡与肉鸡分离株的抗菌药物耐药性：通过肉鸡表型药敏和种鸡基因型预测，肉鸡中CIP耐药44/188（23.4%）、NAL耐药50/188（26.6%）、TET耐药15/188（8.0%）；50株表型耐药肉鸡中，CIP-NAL-TET联合耐药15株（30.0%）、CIP-NAL耐药29株（58.0%）、NAL单耐药6株（12.0%）。CIP和NAL耐药见于2014、2016、2018和2019年，TET耐药仅见于2014和2016年，2015和2017年耐药很少或无。种鸡仅有基因型数据，预测喹诺酮耐药5/145（3.4%）、TET耐药10/145（6.9%）；2017—2019年未检测到耐药种鸡株。肉鸡基因型喹诺酮耐药48/188（25.5%）、TET耐药16/188（8.5%），与表型一致性高（敏感性96.0—100.0%，特异性99.4—100.0%），仅少数不一致。结论：耐药集中在特定年份，肉鸡高于种鸡，基因型预测总体可靠。

（3）耐药决定因子在不同MLST CC中的分布：通过基因型与表型关联分析，喹诺酮耐药见于ST-45 CC 5/156（3.2%）、ST-206 CC 33/35（94.3%）、ST-21 CC 9/17（52.9%）、ST-952 CC 1/7（14.3%）、ST-658 CC 3/3（100%）和ST-52 CC 1/1（100%）。种鸡喹诺酮耐药株均携带gyrA T86I；肉鸡48株喹诺酮耐药基因型中5株ST-45 CC携带gyrA T86A而非T86I，且仅对NAL表型耐药、不对CIP耐药。TET耐药基因型见于ST-206 CC 14/35（40.0%）、ST-952 CC 2/7（28.6%）、ST-658 CC 2/3（66.7%）、ST-1034 CC 1/1（100%）及7株未分CC分离株。种鸡10株TET耐药基因型中，1株ST-122携带tet(O/32/O)，其余9株携带tet(O)；肉鸡中ST-658耐药与tet(O)相关，13株ST-122均与tet(O/32/O)相关；FIXT-145携带tet(O)但表型敏感，进一步分析发现tet(O)非 synonymous 突变导致R623H。几乎所有种鸡（135/145，93.1%）和肉鸡（177/188，94.1%）携带bla_OXA基因并预测对氨苄西林耐药，但未测定表型；17株（5.1%）按所查基因和突变预测为全敏感。结论：喹诺酮和TET耐药高度依赖MLST CC，ST-206 CC耐药富集，ST-45 CC多敏感。

（4）核心基因组MLST（cgMLST）聚类及耐药决定因子在簇中的分布：通过自建cgMLST分析，在最大11个等位差异下识别54个簇（每簇2—14株）。17/54（31.5%）为两个月内同一农场的重复采样，代表同一农场不同隔间或鸡舍同时饲养的种鸡或肉鸡群，其中16/17（94.1%）为敏感簇。19个仅含种鸡的簇均对所研究抗菌药物敏感且较小（2—4株，来自最多2个农场）。22个仅含肉鸡的簇中，17个敏感、1个CIP-NAL-TET耐药（ST-658 CC）、4个CIP-NAL耐药（ST-21 CC、ST-45 CC和ST-206 CC）。13个簇同时含种鸡和肉鸡分离株，多数敏感并代表ST-45 CC或ST-677 CC；两个混合簇耐药，分别为CIP-NAL-TET和CIP-NAL，代表ST-122（ST-206 CC）和ST-227（ST-206 CC）。4/5（80.0%）喹诺酮耐药种鸡株属于这两个耐药簇，而9/10（90.0%）TET耐药种鸡株为簇外散在发现。肉鸡耐药株多属于种鸡—肉鸡混合簇或肉鸡-only簇：喹诺酮耐药40/48（83.3%），TET耐药15/16（93.8%）。系统发育基因组分析中种鸡和肉鸡分离株散布于树中，但存在一个种鸡富集分支（n = 50），主要含未分CC的多种ST。结论：耐药克隆明显成簇，混合簇中耐药少见，基因组证据不支持垂直传播。

（5）cgMLST簇的时空分析：通过农场地址距离和采样时间分析，识别7个耐药簇。最大耐药簇1含14株ST-2104（ST-206 CC）肉鸡分离株，主要采样于2018年7—8月，另1株于2019年8月，来自Ostrobothnia地区38 km内的6个农场。第二大耐药簇2含14株ST-122（ST-206 CC）分离株，主要为肉鸡，采样于2014年9—10月、2015年6月和2016年2—3月，来自55 km内的13个农场。其余耐药簇含2—5株，均在5个月内采自1—2个农场。部分相同农场涉及耐药簇1、2、28和44；ST-206 CC或ST-21 CC耐药簇内农场距离通常≤55 km，ST-45 CC耐药簇16内农场距离达169 km，ST-45 CC敏感簇内农场距离达243 km，所有成簇农场彼此在291 km内。同一C. jejuni克隆在单一 ST-45 种鸡农场相隔近一年检出（簇9），提示跨连续非重叠种鸡生产周期持续；相同基因型也见于相隔1个月的屠宰批（簇20，ST-45；簇32，ST-230），反映同农场不同隔间同时饲养而非连续周期；簇16中农场48阳性肉鸡批早于169 km外农场113首批阳性1个月，农场113第二批阳性在3个月后检出同一克隆，提示跨连续肉鸡生产周期持续。结论：耐药克隆呈区域性聚集，并可在生产周期中持续。

（6）种鸡与肉鸡C. jejuni分离株的流行病学联系：通过种鸡—肉鸡追溯信息分析，13株种鸡分离株与流行病学相关的后代肉鸡分离株具有相同ST；其中12/13（92.3%）为ST-45（ST-45 CC）且基因型对喹诺酮和TET敏感，1株为ST-203（ST-45 CC）；8/13（61.5%）属于cgMLST簇3、9、20、22和46；但没有任何cgMLST簇同时包含种鸡分离株和流行病学相关肉鸡分离株。结论：该结果反驳垂直传播的可能性。

讨论部分总结：欧盟2022—2023年肉鸡C. jejuni分离株CIP耐药率为70.9%、TET为50.7%，而芬兰分别为1.4%和0.0%；但芬兰2014—2019年在2014、2016、2018和2019年出现CIP年耐药率8.4—25.5%、TET 6.0—17.0%的峰值，2015和2017年无耐药。本研究中2014年肉鸡CIP和TET耐药率高于种鸡；2015和2016年种鸡TET基因型耐药率高于FINRES-Vet肉鸡表型监测，但肉鸡表型与基因型一致。种鸡耐药低且年际波动、种鸡与肉鸡耐药时间模式不一致，提示种鸡群不是芬兰肉鸡生产耐药性的主要或稳定来源，但种鸡散在耐药仍需持续监测。种鸡和肉鸡均以ST-45 CC、ST-677 CC和ST-206 CC等少数谱系为主并伴多样散在ST；种鸡缺ST-21 CC且存在一个系统发育富集分支，但总体为混合种群。2013—2014年种鸡进口来源变化，但耐药簇涉及不同进口来源父母代肉鸡，且既往比较基因组研究显示芬兰C. jejuni种群与法国、英格兰、荷兰、瑞典和丹麦不同，结果提示芬兰种鸡分离株主要为本地种群而非输入谱系。耐药高度谱系相关：ST-206 CC中94.3%喹诺酮耐药、40.0% TET耐药，ST-45 CC仅3.2%喹诺酮耐药且全部TET敏感，ST-21 CC 52.9%喹诺酮耐药但TET敏感；因采样偏倚未做正式统计检验，但模式与既往研究基本一致。gyrA C257T（T86I）最常见；A256G（T86A）仅见于5株ST-45 CC肉鸡分离株，与NAL耐药相关而不与CIP耐药相关，ResFinder等数据库据T86I和T86A预测氟喹诺酮耐药可能误导纯基因型分析。芬兰在数据收集期间及此前未使用喹诺酮类，农场用药不能解释耐药克隆传播；既往研究提示喹诺酮耐药对C. jejuni在鸡肠道内适应代价小甚至有利。超过90%分离株携带bla_OXA，但未检测β-内酰胺表型，既往研究显示仅携带bla_OXA与β-内酰胺耐药不直接相关。种鸡多为tet(O)且不与氟喹诺酮耐药或特定ST一致；肉鸡多为tet(O/32/O)嵌合基因并伴gyrA C257T（T86I），且tet(O/32/O)仅见于ST-122种鸡（n = 1）和肉鸡（n = 13）。2014、2015、2016和2019年种鸡 rearing 或 laying 期偶用TET而肉鸡不用，可能部分解释种鸡与肉鸡差异；种鸡耐药株可能由外部来源如野鸟偶入并在选择压下持续，既往芬兰野鸟研究支持多种ST的TET耐药C. jejuni。FIXT-145携带tet(O)却表型敏感，发现R623H突变，研究者提出该非同义突变导致耐药缺失的假设，需未来研究验证，并称为首次报告该突变。研究未发现垂直传播证据但存在不确定性：多数肉鸡群由多个亲本群来源，部分肉鸡群缺乏流行病学相关亲本群数据；种鸡群抗生素治疗数据缺失，来源国数据仅部分可用；种鸡和肉鸡仅在屠宰时采样，每群仅1株做WGS，缺乏生命周期早期污染状态和群内菌株多样性。既往瑞典农场研究曾报道单次采样中肉鸡与相关亲本群分离株cgMLST谱相似，提示垂直传播，但卵传证据仍少，可能经蛋壳粪便污染介导，需弯曲菌在干燥等恶劣条件存活；芬兰孵化场主要用戊二醛雾化消毒种蛋蛋壳和运输箱，本研究未发现该生物安全措施失败。相反，结果提示耐药C. jejuni克隆区域传播：ST-206 CC和ST-21 CC耐药簇主要在Ostrobothnia地区连续1—3年出现，并涉及部分相同或邻近农场；区域传播进一步提示农场间存在环境传播途径，但屠宰场采样数据未能识别。Ostrobothnia动物生产集中，后续应研究附近牛和毛皮动物农场等潜在来源；ST-45 CC簇地理范围更广，提示不同基因型环境适应和传播机制不同，既往研究提示ST-45 CC可在禽宿主外存活并经环境暴露污染家禽。尽管农场间传播机制需进一步研究，结果强调加强农场生物安全，因为同一农场不同肉鸡舍常被同一C. jejuni克隆污染；遵循all in—all out并批次间清洁消毒的芬兰农场中，连续肉鸡群间传播证据少；thinning是肉鸡场弯曲菌感染主要风险因素，建议维持all in—all out以保持芬兰肉鸡群C. jejuni低流行并提高肉鸡食品安全。

研究结论翻译：研究人员的发现表明，芬兰肉鸡生产中氟喹诺酮耐药C. jejuni的阶段性激增由区域克隆性传播而非种鸡群垂直传播驱动。耐药分离株与特定谱系尤其ST-206克隆复合体（clonal complex，CC）密切相关，并显示在邻近农场间局部传播的证据。相反，基因组分析未提供耐药菌株从种鸡群向肉鸡群垂直传播的证据。这些结果凸显农场层面生物安全和基因组监测对于识别新发耐药克隆及改进家禽生产中抗菌药物耐药弯曲菌控制的重要性。