《Oecologia》：Expanding the geographic and host range of moss-nostocacean symbioses in central Europe
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自重新发现以来，苔藓-蓝藻共生体（Moss-cyanobacterial symbioses）日益引起人们的研究兴趣，尤其是念珠藻-羽状苔藓共生体（Nostoc-feather moss symbioses）。历史上，记录念珠藻-羽状苔藓共生体的工作主要集中在
自重新发现以来，苔藓-蓝藻共生体（Moss-cyanobacterial symbioses）日益引起人们的研究兴趣，尤其是念珠藻-羽状苔藓共生体（Nostoc-feather moss symbioses）。历史上，记录念珠藻-羽状苔藓共生体的工作主要集中在斯堪的纳维亚和北美北方森林地带。本文报道了在德国弗兰肯（Franconia）地区进行的多次机会性调查结果，调查涉及林地地面的塔藓（Hylocomium splendens）以及生长在三种树种（欧洲水青冈 Fagus sylvatica、欧洲白蜡树 Fraxinus excelsior 和 Sorbus schuwerkiorum）上的四种苔藓（Orthotrichum lyellii、Zygodon dentatus、Homalia trichomanoides、Pseudoamblystegium subtile）中念珠藻科（Nostocaceae）-苔藓共生体的发生情况。利用基于培养和显微镜的方法，研究人员确认了该地区此类共生体的存在。研究记录了该共生体的四种新苔藓宿主物种，分别属于附生苔藓科木灵藓科（Orthotrichaceae）（Orthotrichum sp. 和 Zygodon sp.），以及平藓科（Neckeraceae）（Homalia trichomanoides）和柳叶藓科（Amblystegiaceae）（Pseudoambylstegium subtile）。这进一步扩展了已知的念珠藻（Nostoc）及念珠藻相关生物（Nostoc-related organisms）的苔藓宿主范围，超出了传统的羽状苔藓（Hypnales目）和泥炭藓（Sphagnum）类群。16S rRNA基因序列比对将苔藓相关的念珠藻及念珠藻相关生物置于念珠藻科的系统发育树中，但未发现明显的单一共生枝系。研究人员注意到，在培养的念珠藻及念珠藻相关生物的基因组中存在多个交替的nifH基因，这可能使其能够在不同的生态条件下进行固氮（diazotrophy）。研究人员还提供了蓝藻可能对苔藓茎进行内生定殖（endophytic colonization）的证据。
苔藓与念珠藻（Nostoc）的共生关系早在一个多世纪前就被记载，近年来的研究尤其关注念珠藻与羽状苔藓（如Hylocomium splendens）的共生体及其在氮循环中的作用。这类共生体的记录主要集中在斯堪的纳维亚和北美北方森林，中欧地区虽有分子证据但直接观察十分稀少。已知宿主多为羽苔目（Hypnales）和泥炭藓属（Sphagnum），附生苔藓是否参与共生尚不清楚。此外，蓝藻能否以内生方式定殖于苔藓茎内也缺乏证据。为此，研究人员在德国弗兰肯地区进行了机会性调查，以确认苔藓-念珠藻科共生体的存在，并扩展宿主范围。
研究人员从该地区林地地面和树皮上采集了5种苔藓样本，包括Hylocomium splendens和四种附生苔藓：Orthotrichum lyellii、Zygodon dentatus、Homalia trichomanoides和Pseudoamblystegium subtile。通过显微镜观察、无氮培养基培养、总DNA提取、PCR扩增以及纳米孔测序等方法，对共生蓝藻进行了形态、培养和分子系统学鉴定。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用落射荧光显微镜（epifluorescence microscopy）检测蓝藻自身荧光；通过化学处理去除苔藓表面附生生物，以探查可能的内生定殖；使用无氮BG-110培养基对类念珠菌生物（Nostoc-like organisms）进行培养分离；对单个菌落进行集落PCR，扩增全长16S rRNA和nifH基因片段，并在Nanopore平台测序；基于序列构建16S rRNA和nifH基因系统发育树。样本采集自德国上、中弗兰肯的多个地点（如菲希特尔山脉、弗兰肯侏罗山），海拔350–800米，采样时间为2023–2025年。
Microscopy：显微镜观察确认5种苔藓上存在类念珠菌菌落，多位于叶腋或叶面，荧光显微镜下可见丝状体和异形胞（heterocysts）。Epiphyte reduction：附生生物去除实验表明，叶片表面附生蓝藻大量减少，但茎部仍保留强烈荧光信号，集中于叶腋区域，提示蓝藻可能占据茎的内部组织。Culture of Nostoc-like organisms：培养分离成功获得4种宿主（Hylocomium splendens、Homalia trichomanoides、Pseudoamblystegium subtile和Zygodon sp.）的类念珠菌培养物；Orthotrichum相关的培养物未能存活，Pseudoamblystegium相关培养物则受到污染，仅获得部分16S数据。Whole-community amplification of nifH gene：对无可见菌落的Hylocomium组织进行无培养nifH PCR，始终扩增出预期大小的产物，同时也出现仅宿主植物才有的更大片段，推测为宿主nifH同源物，表明分子检测可揭示肉眼不可见的蓝藻存在，但需注意宿主序列干扰。Phylogenetic placement of nifH genes from cultured Nostoc-like organisms：在Zygodon和Homalia相关的培养物中分别检测到3个不同的nifH拷贝，且落入Kubota–Ininbergs树的不同枝系；其中Homalia相关菌株的nifH落于传统“Stigonema枝系”，而其16S序列却与Nostoc pruniforme最接近。Hylocomium相关菌株仅获单一nifH共识序列。多个nifH拷贝的存在提示同一菌株可能携带多种交替固氮酶。Phylogenetic placement of 16S genes from cultured Nostoc-like organisms：基于856条参考序列构建的16S系统发育树显示，4种培养物的16S序列分散于Nostocaceae不同位置，未形成单一共生枝；Pseudoamblystegium和Hylocomium相关菌株与地衣或Gunnera内共生念珠菌近缘，Zygodon相关菌株与自由生活的Compactonostoc属最接近，Homalia相关菌株与淡水自由生活的Nostoc pruniforme接近。
研究人员将这类共生体的地理分布扩展至中欧，并首次报道了木灵藓科等非羽苔类苔藓作为宿主，表明共生可能发生在更广泛的苔藓类群中。系统发育结果没有显示单一的共生枝系，说明共生关系在进化上较为宽松。培养物中发现多个交替nifH基因，可能适应树冠内波动性环境，但这也意味着利用nifH基因进行系统发育和功能群归属时需要谨慎，因为单株菌可携带不同枝系的nifH序列。关于内生定殖的证据，虽然荧光信号和nifH扩增提示蓝藻可能在茎内，但表面去除不完全及宿主同源序列干扰使得该结论仍不确定，有待更多实验证实。
研究人员将经典的羽状苔藓Hylocomium与念珠藻共生体的已知地理范围进一步扩展至中欧地区，突显了苔藓层在中欧山地森林氮循环中的重要性。研究人员扩展了该共生体的已知宿主范围，包括非羽苔类苔藓（Orthotrichum和Zygodon）以及其他先前未观察到的羽苔类苔藓（Pseudoamblystegium、Homalia）。研究人员注意到，一些类念珠菌生物内部可以发现多个nifH基因版本，这可能代表了它们对动态森林冠层环境的适应，但这也意味着在利用nifH基因序列数据鉴定这些Nostocaceae共生体时需要格外谨慎。研究人员还报告了一个可能的高蓝藻定殖位点，即苔藓“茎”（caulid）的内生区室。如果确实如此，这将暗示一种丰富且受物理保护的共生关系，但不是以Nostoc大菌落阶段存在。总体而言，这些结果有助于弥合两类常见森林苔藓共生体之间的差距：（1）少数对少数的羽状苔藓/Nostoc共生体，以及（2）多对多的苔藓/蓝藻群落共生体。从本次调查来看，前者在该地区相对罕见；而根据其他报道，后者在氮限制环境中普遍存在，包括本地区。
