《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Production of PMWaV-free pineapple plants using combined thermotherapy and etiolation during micropropagation
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菠萝粉蚧枯萎病（mealybug wilt of pineapple, MWP）是影响全球菠萝生产的经济上重要的病毒病害。在巴西，MWP与菠萝粉蚧枯萎相关病毒（pineapple mealybug wilt-associated viruses, PMWaV-
菠萝粉蚧枯萎病（mealybug wilt of pineapple, MWP）是影响全球菠萝生产的经济上重要的病毒病害。在巴西，MWP与菠萝粉蚧枯萎相关病毒（pineapple mealybug wilt-associated viruses, PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3）相关，主要通过无性繁殖材料传播，因为受感染植株常保持无症状。离体繁殖技术为产生无病原种植材料提供了可靠途径。本研究旨在将热疗和黄化处理与茎尖培养相结合，建立优化方案以生产无病毒‘Vitória’菠萝植株。由表现MWP症状的‘Vitória’菠萝植株腋芽增殖获得的离体枝条，分别接受35、37和39（±1）°C热疗35 d，或在连续黑暗下培养30、60和90 d以诱导黄化。热疗或黄化处理后，切取茎尖（≈2.0 mm）并进行离体培养90 d，随后取叶片样品通过逆转录定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR, RT-qPCR）进行病毒检测。黄化诱导60和90 d导致PMWaV-3被清除。39（±1）°C热疗在所有测试样品中实现PMWaV-1和PMWaV-3消除，并在67%样品中消除PMWaV-2，茎尖再生率为37%。无病毒枝条随后进行离体增殖，在温室驯化后移栽田间，在两个生产周期中保持健康。所开发方案为大规模生产无病毒种植材料提供了有价值的方法，以经济有效的方式满足种植者需求。
研究背景：菠萝是热带地区重要的经济与社会性果树，而无性繁殖导致病毒随冠芽、吸芽等繁殖材料累积和传播。菠萝粉蚧枯萎病（mealybug wilt of pineapple, MWP）是影响菠萝生产的重要病毒病害，由菠萝粉蚧枯萎相关病毒（Pineapple mealybug wilt-associated virus, PMWaV）复合体引起，主要由粉蚧传播；巴西已报道PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3，其中PMWaV-2与严重症状关系密切。感染株常因环境、粉蚧种群和基因型等因素保持无症状，使病苗难以识别。化学防治粉蚧虽可减少传播，但存在环境与健康风险。离体繁殖结合脱毒技术可为生产无病毒种苗提供途径；热疗（thermotherapy）、黄化处理（etiolation）和茎尖培养（shoot tip culture）可单独或联合用于脱毒，但菠萝常规脱毒所需茎尖很小（0.5–1.0 mm），操作困难、死亡率高，不利于规模化。因此，研究人员以‘Vitória’品种为对象，首次针对该品种建立结合热疗、黄化和茎尖培养的脱毒微繁殖方案，以期使用较大茎尖、提高操作效率并获得无PMWaV种苗。
关键技术方法（不超过250字）：以Incaper表现MWP症状且经RT-qPCR索引的‘Vitória’菠萝为样本来源，取腋芽离体增殖；分别进行35、37、39（±1）°C暗培养35 d热疗，以及25（±2）°C连续黑暗30、60、90 d黄化处理；处理后切取约2.0 mm茎尖继代培养，90 d后取叶样以PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3特异引物行RT-qPCR检测。无病毒芽系扩繁、温室驯化并田间种植，两个生产周期后取六株叶基样本行RT-PCR验证；另对离体种质库材料检测。试验采用完全随机设计（completely randomized design, CRD），进行方差分析（analysis of variance, ANOVA）和Tukey检验。
研究结果：
Effect of heat treatment on shoot development：35（±1）°C处理35 d不影响‘Vitória’菠萝枝条存活；37和39（±1）°C在18 d时不影响存活，但35 d后存活率分别降至90%和73%。35（±1）°C暗培养枝条生长率在18 d和35 d分别为3.3 cm和4.6 cm，高于对照的0.7 cm和1.5 cm，节数由1.0增至1.5，并出现“浅绿色、叶基白色”等黄化特征；37和39（±1）°C暗培养则抑制生长且不表现黄化。由此得出，35（±1）°C可诱导黄化并保持较高存活，而更高温度抑制生长。
Shoot tips after thermotherapy and clonal cleaning：热疗后切取茎尖再培养15 d，25（±2）°C和35（±1）°C处理茎尖存活率为100%，37（±1）°C为67%，39（±1）°C为47%；37和39（±1）°C处理茎尖因褐变坏死而失去活力。30 d时，25、35、37和39（±1）°C处理茎尖再生率分别为100%、90%、67%和37%。RT-qPCR显示，39（±1）°C处理35 d可在全部 analyzed 样品（6/6）中清除PMWaV-1和PMWaV-3，并在3个 analyzed 样品中的2个清除PMWaV-2；对照25（±1）°C枝条仍感染PMWaV-1和PMWaV-2，且有1个样品PMWaV-3阳性。由此得出，39（±1）°C热疗35 d结合茎尖培养具有较强脱毒潜力，但PMWaV-2较难清除且再生率较低。
Effect of the dark period on shoot development：黄化处理各时期枝条存活率均为100%。30、60和90 d暗培养的生长率分别为4.5、5.3和6.2 cm，高于培养室对照的1.2、3.7和4.8 cm；平均高度分别为7.4、8.0和9.1 cm，对照分别为3.8、6.0和7.4 cm；节数随暗培养延长增至3.7、5.5和7.3。由此得出，黄化可促进节间伸长和节点形成，且不降低存活。
Shoot tips after etiolation induction and viral diagnosis：黄化后茎尖再培养15 d，30 d暗处理存活率为87%，60 d为97%，90 d为100%，对照为100%；30 d时再生率在对照、30、60和90 d暗处理分别为100%、80%、93%和97%。RT-qPCR显示，单独黄化90 d内未清除PMWaV-1和PMWaV-2，但60和90 d后未检出PMWaV-3；对照对PMWaV-1和PMWaV-2呈强阳性、对PMWaV-3呈弱阳性；PMWaV-2病毒载量很高且处理无效，PMWaV-1表现居中，未产生无病毒芽。由此得出，单独黄化不足以清除PMWaV-1和PMWaV-2，对PMWaV-3的阴性结果可能与原始材料载量较低有关。原文结果末段还显示，田间采集的6株样品及Incaper活性种质库中10份以上离体样品对PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3检测均为阴性。
讨论总结：研究人员指出，热疗需在病毒灭活与植物材料存活之间取得平衡；35–42°C、4–6周是常用范围，温度越高、时间越长通常脱毒率越高但存活率下降。35（±1）°C虽保持材料活力，却不能灭活或清除PMWaV，尤其PMWaV-2；35（±1）°C结合黄化和茎尖培养可在67%植株中清除PMWaV-1和PMWaV-3，但未有效清除PMWaV-2，可能与该病毒载量较高有关。黄化使节间伸长，病毒复制和/或移动可能跟不上顶端快速伸长，从而提高获得无病毒茎尖的机会；‘Vitória’黄化枝条生长优于文中比较的其他菠萝材料，但过度伸长使茎变细，切取茎尖时易折断并造成损失。37和39（±1）°C抑制生长；37（±1）°C处理35 d的茎尖存活率与其他作物热疗结果相比可接受；39（±1）°C处理35 d的茎尖存活率为47%，可完全清除PMWaV-1和PMWaV-3，并在67%样品中清除PMWaV-2，后者与‘Elektra’梨对Apple stem pitting virus（ASPV）的脱毒结果相近。PMWaV-2最难清除，可能源于病毒自身特性或原始材料中病毒载量高。单独黄化未清除PMWaV-1和PMWaV-2，PMWaV-3在黄化后阴性可能因原始繁殖材料载量低；黄化设备要求较低，但对某些病原体效率可能较低。39（±1）°C热疗后切取约2.0 mm茎尖仍可实现脱毒，较0.5–1.0 mm茎尖更易操作、再生更好，且无需体视显微镜，利于规模化；热疗可抑制病毒复制、增加RNA降解并减少病毒移动，从而允许使用较大茎尖。无病毒离体植株在田间两个生产周期后仍健康，支持将无病毒微繁殖苗作为综合病害管理策略。
研究结论翻译：生产无病毒繁殖材料是控制栽培植物病毒病害的重要策略，对菠萝等无性繁殖作物尤为重要。本研究显示，离体技术与热疗后茎尖培养相结合，对清除感染菠萝植株中的PMWaV更有效，并经实时PCR有效索引，获得无病毒离体植株。由39（±1）°C处理35 d的枝条切取2.0 mm茎尖，可有效清除PMWaV复合体，确认该方案用于‘Vitória’菠萝无性系脱毒的潜力。39（±1）°C处理35 d可使73%的植物材料存活，并完全清除PMWaV-1和PMWaV-3，在67%的测试样品中清除PMWaV-2。在切取茎尖前加入热疗，允许使用较大茎尖（≈2.0 mm），提高存活率并免除体视显微镜需求，降低无菌层流台操作难度和操作技能要求，使过程更简便、快速和经济。因此，所建立方案可用于健康菠萝种苗的大规模生产。该整合方案可实现无PMWaV植株的微繁殖，较常规繁殖具有潜在优势，可为育种计划提供无病毒材料以保护遗传资源，并可支持高效PMWaV根除计划及高健康母株供应，对病害管理、生产力和果实品质保障具有重要意义。
