基于深度学习预测发现新GH5纤维素酶：先导酶开发与胞外生产验证

《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》：Sequence-diversity-guided discovery, model-guided mutagenesis, and secretory production of GH5 endoglucanases in Bacillus subtilis

　　

摘要

背景

纤维素酶是木质纤维素降解的核心酶类，但鉴定更多的糖苷水解酶5族（GH5）酶仍进展缓慢。深度学习预测器不断涌现，然而鲜有研究将预测结果进一步通过实验验证并在生产宿主中进行测试。

结果

我们基于CatPred从聚类UniProt序列（初始25,148条条目）和以EglS为种子的同源搜索结果中进行筛选，并辅以两条比较路线，组装了23基因面板。在大肠杆菌中表达后，22个候选基因在羧甲基纤维素（CMC）上进行测定，EglS作为单独对照。AQSP_CL和MACA_CL此前未见任何生化表征报道，我们将它们与EglS及嗜热基准酶Cel5A一同纯化。两种新酶在短时测定中的最适温度均为70 °C。AQSP_CL在pH 5.0时活性最高，其基于质量的CMC动力学效率估计值与EglS接近（0.201对比0.231 U·mL·mg?1）；Cel5A具有更强的热稳定性。在8个鉴定一致的候选基因中，CatPred对纤维四糖的预测与裂解物CMC活性未检测到相关性（ρ = 0.10，p = 0.82）。在集成对接中，AQSP_CL满足操作距离标准的构象比例最高（52.0%对比28.7–39.0%），但差异在构象体层面未能分辨，且Vina评分无法区分各酶。首轮筛选中，M65Q单一突变体的裂解物活性最高（为野生型的1.61倍）。基于首轮数据训练的少样本模型提名了第二轮突变文库，但加性预测无法推广至组合突变。信号肽SP3使亲本AQSP_CL在枯草芽孢杆菌中的胞外活性较无信号肽构建体提高约八倍。

结论

本研究将两种GH5内切纤维素酶的发现与计算提名方案的实验评估、先导酶开发及胞外生产联系起来。AQSP_CL为生物质降解研究提供了新的骨架分子。CMC和烧瓶规模的测定确立了酶的性质和胞外回收率；生物质的转化性能尚待评估。