芜菁介导绿色合成氧化镁纳米颗粒MgO NPs通过ROS驱动抗菌及抗生物膜活性对抗多重耐药革兰阴性菌的研究

《International Microbiology》：Green synthesis of Brassica rapa–mediated magnesium oxide nanoparticles MgO NPs with ROS-driven antibacterial and antibiofilm activities against multidrug-resistant gram-negative bacteria

　　

多重耐药革兰阴性菌形成抗生素耐药生物膜的能力使其能够在各种环境中持续生存。本研究采用芜菁（*Brassica rapa*）介导的环境可持续绿色方法合成了氧化镁纳米颗粒（MgO NPs），并评价了其对鲍曼不动杆菌（*A. baumannii*）、铜绿假单胞菌（*P. aeruginosa*）、肺炎克雷伯菌（*K. pneumoniae*）和大肠埃希菌（*E. coli*）临床分离株的抗菌及抗生物膜活性。研究人员通过肉汤微量稀释法和微量滴定板法检测了这些纳米颗粒的抗菌和抗生物膜活性。生物源MgO NPs表现出强效抗菌活性，其最低抑菌浓度（MIC）为125–250 μg/ml，最低杀菌浓度（MBC）为500–1000 μg/ml。在50 μg/ml浓度下作用48小时，浮游菌生长抑制率超过90%；在100 μg/ml浓度下作用72小时，抑制率可达99%。在50 μg/ml浓度下，生物膜形成被抑制60%–90%，而经延长暴露时间后，已形成的生物膜减少97%–99%。机制研究表明，胞外聚合物质（EPS）受到显著破坏，其中蛋白质减少68%，碳水化合物减少55%，胞外DNA减少33%，同时胞内活性氧（ROS）水平同步增加2–3倍。结果表明，芜菁来源的MgO NPs可作为有效且可持续的纳米材料，阻止多重耐药革兰阴性病原体形成生物膜。

# 论文深度解读：芜菁介导绿色合成MgO NPs对抗多重耐药革兰阴性菌生物膜的研究

## 一、研究背景与问题提出

抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）已成为威胁全球公共卫生的紧迫问题。据文献报道，COVID-19疫情后全球每年因耐药菌感染导致的死亡人数高达471万。世界卫生组织（WHO）于2017年发布的"重点病原体"清单中，多数为革兰阴性菌，这与其独特的细胞壁结构密切相关。革兰阴性菌对β-内酰胺类、喹诺酮类等多种抗菌药物具有天然耐药性，而其形成生物膜的能力更加剧了这一问题。

生物膜是由微生物群落及其分泌的胞外聚合物质（extracellular polymeric substances, EPS）组成的复杂结构，约80%的人类持续性及复发性感染与生物膜相关。生物膜介导耐药性增强的主要机制包括：抗生素难以穿透致密的生物膜结构、外排泵系统主动将抗生素泵出膜外、以及多菌种生物膜群落内部形成的保护性或协同性关系。此外，生物膜还促进了微生物间的遗传物质交换和协同代谢，进一步加速了耐药基因的传播。

传统抗菌策略的局限性促使研究者探索新的替代方案。纳米技术因其独特的理化性质成为对抗耐药菌的重要方向，其中金属氧化物纳米颗粒因其尺寸可控、表面可修饰和内在抗菌活性而备受关注。氧化镁纳米颗粒（MgO NPs）因其无毒、高稳定性和广谱应用前景成为研究热点。然而，传统的物理和化学合成方法存在环境污染问题，因此开发环境友好的绿色合成方法成为迫切需求。植物介导的绿色合成利用植物中丰富的天然活性成分作为还原剂和稳定剂，具有简单、适应性强和生态友好等优势。

芜菁（*Brassica rapa*）作为一种药食两用植物，富含酚类、含硫化合物、类黄酮和类异戊二烯等生物活性成分，其降解产物异硫氰酸酯具有显著的抗菌活性，可通过破坏细胞膜和干扰微生物代谢过程导致菌体死亡。基于此，本研究首次采用芜菁提取物绿色合成MgO NPs，并系统评价其对多重耐药（multidrug-resistant, MDR）革兰阴性菌的抗菌和抗生物膜活性及潜在机制。

## 二、研究内容概述

研究人员以巴基斯坦费萨拉巴德当地市场采集的新鲜芜菁叶片为原料，制备水提物后与硝酸镁（MgNO₃）和氢氧化钠（NaOH）反应，经煅烧获得白色MgO NPs粉末。实验所用菌株为从费萨拉巴德政府学院大学微生物研究所获取的临床MDR分离株，包括鲍曼不动杆菌（*Acinetobacter baumannii*，登录号MH605335）、肺炎克雷伯菌（*Klebsiella pneumoniae*，登录号MF953599）、铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*，登录号MK793697.1）和大肠埃希菌（*Escherichia coli*，登录号KY305421.1）。研究人员通过琼脂孔扩散法、微量肉汤稀释法和微量滴定板法分别评价了MgO NPs的抑菌圈直径、最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）和最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration, MBC）；通过紫外-可见分光光度法（UV-vis）、傅里叶变换红外光谱法（FTIR）、能量色散X射线分析（EDX）和扫描电子显微镜（SEM）对纳米颗粒进行表征；通过NBT还原法检测胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平变化，通过结晶紫染色法、刚果红琼脂（CRA）法和EPS组分定量分析评价抗生物膜活性及机制。所有实验均设三重复，采用双因素方差分析（two-way ANOVA）和Tukey多重比较检验进行统计分析。

## 三、主要研究结果

### （一）MgO NPs的绿色合成与表征

研究人员通过芜菁叶片提取物成功合成MgO NPs，获得白色结晶产物。UV-vis光谱在295 nm处显示特征吸收峰，证实了纳米颗粒的形成；FTIR光谱在500–600 cm^?1处显示强Mg–O振动带，确证了高纯度结晶态MgO的生成，同时在3400 cm^?1附近出现O–H伸缩带，表明表面存在羟基化和吸附水分。EDX分析显示Mg（27.6 wt%）和O（54.9 wt%）为主导元素，接近化学计量比；SEM观察显示纳米颗粒呈球形至准球形，边界清晰，平均尺寸为62.78 nm，呈均匀分布。

### （二）抗菌活性评价

琼脂孔扩散法结果显示，MgO NPs对MDR革兰阴性菌表现出剂量依赖性抑菌活性，抑菌圈直径范围为14–29 mm，其中对肺炎克雷伯菌的抑菌圈最大（29 mm），其次为铜绿假单胞菌（27 mm）。在62.5 μg/ml的最低测试浓度下，所有受试菌株均未观察到抑菌圈。微量肉汤稀释法测定MIC值为125–250 μg/ml，其中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的MIC最低；MBC值为500–1000 μg/ml，铜绿假单胞菌和大肠埃希菌在500 μg/ml浓度下即被杀灭。

### （三）ROS产生效应

研究人员以50 μg/ml的亚抑菌浓度处理细菌细胞后发现，与未处理对照组相比，所有受试菌株的ROS水平均显著升高，增加幅度为2–3倍，其中大肠埃希菌的ROS产生量最高，铜绿假单胞菌次之。这一结果表明，ROS介导的氧化应激是MgO NPs抗菌作用的重要机制之一。

### （四）浮游菌生长抑制与生物膜形成抑制

MgO NPs对浮游菌生长的抑制作用呈浓度和时间依赖性。在0.25×MIC浓度下仅观察到适度抑制效应，在0.5×MIC浓度下48小时内生长抑制率超过90%，在1×MIC浓度下大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌几乎完全被抑制。

在生物膜形成抑制方面，MgO NPs对所有受试菌株均具有预防作用。0.25×MIC浓度下生物膜抑制率为30%–70%，0.5×MIC浓度下抑制率可达60%–90%，1×MIC浓度下在延长处理时间后抑制率超过90%。其中大肠埃希菌对MgO NPs介导的生物膜抑制最为敏感，最高抑制率约97%；鲍曼不动杆菌约94%；铜绿假单胞菌约93%；肺炎克雷伯菌的抑制率最高达约90%。

### （五）生物膜基质组分破坏

MgO NPs处理显著干扰了生物膜EPS的关键组分。蛋白质含量减少最为显著，铜绿假单胞菌蛋白抑制率持续高于49%，大肠埃希菌从24小时的39.5%升至72小时的约60%，肺炎克雷伯菌蛋白抑制率全程高于60%并在24小时达到峰值67.8%。碳水化合物含量方面，鲍曼不动杆菌在24小时即显示65.6%的强效抑制，肺炎克雷伯菌在48小时达到55.2%的峰值抑制率。胞外DNA含量变化相对温和，肺炎克雷伯菌在72小时显示最高DNA抑制率达32.7%，表明不同菌株对EPS组分破坏的敏感性存在差异。

### （六）成熟生物膜清除效果

MgO NPs对预先形成的成熟生物膜同样具有显著的清除作用。0.25×MIC浓度下仅显示3.46%–11.3%的轻度抑制；0.5×MIC浓度下24小时内生物膜破坏率即超过50%，48小时超过87%，72小时对大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌接近完全抑制（>97%）；1×MIC浓度下，72小时后大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的成熟生物膜清除率分别达99%和99.1%，铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌也分别显示99.5%和97%的显著清除率。

### （七）黏液产生抑制

刚果红琼脂（CRA）法检测显示，添加亚抑菌浓度MgO NPs后，细菌菌落在CRA培养基上的典型黑色菌落特征消失，转变为粉白色，直观证实了EPS产生能力的显著下降，进一步支持了MgO NPs的抗生物膜活性。

## 四、结论与展望

本研究首次报道了利用芜菁提取物绿色合成MgO NPs并系统评价其对MDR革兰阴性菌的抗菌和抗生物膜活性。研究证实，生物源MgO NPs不仅能抑制浮游菌生长，还能通过破坏EPS组分（蛋白质、碳水化合物和胞外DNA）阻止生物膜形成并分解已建立的生物膜。其作用机制涉及多重协同因素：NPs附着于细菌细胞壁并释放Mg²⁺离子、诱导ROS过量产生造成氧化应激损伤、干扰EPS合成以及抑制黏液产生。

与既往研究对比，本研究所合成的MgO NPs显示出优于部分化学合成和植源合成方法的抗菌活性，且其抗生物膜效果显著高于已有报道。差异可能与合成工艺、粒径大小及菌株特异性耐药机制有关。研究结果表明，植物源MgO NPs不仅能破坏细菌的结构组分，还能干扰其代谢功能，从而有效突破革兰阴性病原体的生物膜防御机制，可作为传统抗菌方法的有力替代方案。然而，研究也指出，将此类NPs应用于临床仍需进一步评估其细胞相容性、体内有效性及递送策略，为后续转化研究指明了方向。