小麦油菜素内酯合成基因DWARF1与DWARF4敲除赋予直立冠层株型

《Theoretical and Applied Genetics》：Knocking-out the brassinosteroid biosynthesis genes DWARF1 or DWARF4 produces upright canopy architecture in wheat

　　

摘要专业翻译 关键信息：小麦dwf4油菜素内酯合成突变赋予直立冠层株型且无产量损失，与dwf1不同，是培育适合高密度种植理想株型的有前景靶点。 摘要：油菜素内酯（BR）调控植物多种农艺性状，包括叶夹角。BR耗竭促进直立冠层株型，可改善谷类作物在高种植密度下的垂直光分布和籽粒产量。然而，BR活性的广泛降低常对育性和籽粒大小产生负面影响。因此，通过靶向特定基因对BR代谢进行空间限制性修饰，可在实现直立冠层的同时最大限度减少不良多效性效应。在BR生物合成途径中，DWARF1/DIMINUTO（DWF1/DIM）编码C-24还原酶，催化第一个特异性甾醇BR前体的产生，而DWF4和DWF11编码在途径后期起作用且具有部分功能冗余的22α-羟化酶。研究人员利用乙基甲烷磺酸盐（EMS）诱导的引入提前终止密码子的突变，在Cadenza背景下生成了DWF1和DWF4三个同源拷贝均缺失功能的小麦品系。dwf4-abd突变体表现出直立叶片和轻微株高降低，但在温室和田间条件下籽粒大小和粒重均无差异。dwf1-abd突变体同样产生直立冠层，但与野生型相比分蘖数、籽粒大小和粒重均降低。dwf1-abd突变体对外源BR处理表现超敏感。代谢物分析显示，与野生型对照相比，dwf1-abd幼苗中BR前体菜油甾醇（CR）、菜油烷醇（CN）和6-氧代菜油烷醇（6-oxoCN）浓度显著降低，而dwf4-abd幼苗中前体水平未降低，与基因冗余一致。

论文解读

一、研究背景与科学问题

油菜素内酯（Brassinosteroids，BR）是调控植物多种农艺性状的重要植物激素，包括茎秆伸长、叶夹角和籽粒大小。BR通过促进茎部细胞伸长影响株高，通过调控叶枕（lamina joint）区域细胞伸长和增殖影响叶夹角。由于这些性状直接贡献于作物株型和产量潜力，研究改变BR合成和信号转导的自然及诱导遗传变异，有助于培育具有最优株高、冠层结构和籽粒产量的作物品种。

在水稻、玉米和大麦等谷类作物中，降低BR合成或信号转导的突变会影响叶枕发育进而改变叶夹角。然而，BR缺陷和BR不敏感植物也表现出负面多效性效应，如育性和籽粒大小降低，限制了其在小麦育种中的应用价值。相比之下，赋予靶向或部分BR信号抑制的等位基因可促进谷类作物产量提升。例如，小麦ZnF-B单倍块缺失赋予中等程度的BR信号降低，产生紧凑直立冠层且无负面多效性效应；水稻中激活BR分解代谢基因BRD3的突变可特异性地在发育穗中降低BR信号，增加穗分枝和粒数而不影响籽粒大小。

另一种调控BR水平的方法是靶向BR合成酶编码基因。DWARF1/DIMINUTO（DWF1/DIM）编码C-24还原酶，将24-亚甲基胆固醇（24-MC）转化为菜油甾醇（CR），即BR的甾醇前体。由于DWF1是催化该反应的唯一酶，dwf1功能缺失等位基因表现出严重的BR水平降低。在大麦、水稻和玉米中，DWF1/DIM直系同源基因的功能缺失突变同样赋予直立叶、半矮化株型、根伸长减少、籽粒缩短和育性降低。相比之下，谷类作物中菜油烷醇（CN）到6-脱氧长花药甾醇（6-deoxoCT）及6-oxoCN到长花药甾醇（CT）的22α-羟化反应由两种细胞色素P450单加氧酶催化：DWARF4（DWF4/CYP90B2）和DWF11（CYP724B1），二者具有部分功能冗余。在水稻中，OsDWF4转录本在叶片中最高，osdwf4-1突变体表现出直立叶冠层和轻微株高降低，不影响生殖发育；而OsDWF11表达更广泛，osdwf11突变体具有半矮化株型、籽粒缩短和紧凑穗。玉米中zmdwf4功能缺失等位基因在密植条件下赋予改善的光合能力、降低的避荫反应和更高产量。

小麦基因组包含DWF1在第七同源群染色体上的同源三联体、DWF11在第二同源群染色体上的三联体，以及DWF4在第四同源群染色体上的三联体。此外，小麦特异的染色体间复制事件产生了第四同源群以外的三个DWF4样基因，但这些基因表达水平极低。迄今，BR合成基因的遗传变异尚未在小麦育种计划中广泛利用，可能因为六倍体基因组的功能冗余掩盖了单个基因突变的效果。

本研究旨在表征面包小麦中DWF1和DWF4的生理功能，并确定这些基因的变异是否能赋予农艺效益。

二、研究内容与主要结论

研究人员在Cadenza背景下，通过鉴定EMS诱导的引入提前终止密码子的点突变，生成了DWF1和DWF4三个同源拷贝全部功能缺失的敲除突变体。杂合三重突变体与Cadenza回交两次以减少背景突变后自交，获得分离群体，并筛选出单突变、双突变和三重突变组合及野生型无效分离系用于表型鉴定。

温室条件下，dwf1-abd和dwf4-abd三重突变体在第二叶和旗叶阶段的叶夹角均显著降低，且dwf1-abd在幼苗期叶夹角降低幅度大于dwf4-abd。dwf1-abd幼苗和成熟株高均显著降低，穗长和上部四个节间长度减少，分蘖数、每穗小穗数、籽粒面积和千粒重均显著低于对照；而dwf4-abd仅幼苗株高显著降低，成熟株高、籽粒性状和分蘖数与对照无显著差异。田间条件下，dwf1-abd株高较Cadenza降低约50%，旗叶夹角显著降低，籽粒面积和千粒重显著降低；dwf4-abd株高降低14%，仅穗和穗下节间显著缩短，籽粒大小和千粒重与Cadenza无差异。

三、主要关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：利用EMS诱变结合外显子捕获测序鉴定目标基因突变，通过KASP基因分型筛选突变组合；在温室和田间条件下进行系统表型鉴定，包括叶夹角、株高、节间长度、穗长、籽粒面积和千粒重等性状测定；利用Rothamsted Research的Field Scanalyzer高通量表型平台进行冠层覆盖度、株高和穗密度的自动化监测；采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-ESI-MS/MS）分析内源BR代谢物含量；利用扫描电子显微镜（SEM）和激光烧蚀断层扫描（LAT）分析叶枕区域的解剖学差异；通过叶枕倾斜实验检测突变体对外源24-表油菜素内酯（epiBL）的敏感性。

四、研究结果

dwf1和dwf4突变体的生成：通过鉴定EMS诱导的提前终止密码子突变，生成了DWF1和DWF4各三个同源拷贝功能缺失的突变体，突变蛋白分别缺失FAD或跨膜结构域、血红素结合结构域等保守功能域。

温室条件下dwf1和dwf4突变体的表型特征：所有单突变和双突变dwf1突变体旗叶夹角较对照轻度但显著降低，三重dwf1-abd突变体降低幅度更大；株高和节间长度仅在dwf1-abd中显著降低，分蘖数在dwf1-abd中降低。dwf4单突变和双突变旗叶夹角也有降低趋势但仅dwf4-bd显著，三重dwf4-abd显著降低；株高和节间长度在所有dwf4突变体中均无显著影响。详细表型分析显示，dwf1-abd和dwf4-abd在幼苗期第二叶和旗叶阶段的叶夹角均显著低于各自无效分离系对照。dwf1-abd第二叶叶片更短更宽，叶面积显著小于dwf4-abd。dwf1-abd成熟株高显著降低，穗长和上部四个节间缩短，每穗小穗数、籽粒面积、千粒重和分蘖数均显著降低；dwf4-abd在这些性状上与对照无显著差异。

dwf1和dwf4突变体叶枕的解剖学差异：SEM显示dwf1-abd和dwf4-abd耳状突起区域细胞长度显著短于Cadenza，叶片更紧密地包裹在叶舌周围。LAT分析显示两个突变体叶枕整体厚度显著大于Cadenza，主要由于中脉到近轴边界距离（D3）增大。dwf4-abd的远轴和近轴区域（D1和D2）显著宽于dwf1-abd和Cadenza。两个突变体D1和D2区域细胞层数均多于Cadenza，其中dwf1-abd的细胞层宽度显著窄于其他基因型。

dwf1和dwf4突变体对BR处理的响应：叶枕倾斜实验中，所有品系对外源epiBL处理均表现为叶夹角增大，但dwf1-abd对10?? M epiBL的响应显著强于其他品系，存在显著的处理与基因型互作效应。

dwf1和dwf4三重突变体内源BR水平分析：dwf1-abd中CR、CN和6-oxoCN浓度分别较DWF1-NS降低126倍、12.8倍和3.7倍；活性BR如栗甾酮（CS）和油菜素内酯（BL）低于检测限。dwf4-abd中CN浓度与DWF4-NS无显著差异，但6-deoxoCT和6-脱氧栗甾酮（6-deoxoTY）显著积累。

Field Scanalyzer高通量表型分析：2020年冬季至2021年夏季监测显示，dwf1-abd在整个生长季冠层覆盖度持续低于Cadenza，生殖期株高降低约25%–30%，开花完成期穗密度显著低于对照。

田间条件下dwf1和dwf4突变体的表型特征：2022年春播田间试验中，两个突变体旗叶夹角均显著低于Cadenza。dwf1-abd株高较Cadenza降低约50%，穗、穗下节间、P-1和P-2节间均显著缩短，籽粒面积和千粒重显著降低。dwf4-abd株高降低14%，仅穗和穗下节间显著缩短，籽粒性状无显著差异。

五、讨论与结论

DWF1对小麦正常地上部株型是必需的：dwf1-abd在温室和田间均表现出显著发育缺陷，包括株高降低约50%、直立且更短更宽的叶片、紧凑穗以及籽粒变小变轻，与水稻、大麦和玉米中DWF1敲除的表型一致，表明DWF1在促进茎伸长和籽粒灌浆中的功能保守。Field Scanalyzer监测显示dwf1-abd冠层覆盖度降低，部分归因于直立表型和较低穗密度。dwf1-abd对外源BL超敏感，CR浓度较对照降低126倍，符合BR缺陷特征。综合株高降低、分蘖减少和籽粒变小，dwf1突变在小麦育种中可能不具有应用价值。

DWF4改变冠层株型且对籽粒发育无负面多效性效应：dwf4-abd在田间表现出旗叶夹角显著降低、穗紧凑和株高轻度降低，籽粒大小和千粒重不受影响，与DWF4在发育籽粒中低表达而DWF1高表达一致。这种器官特异性效应与水稻中DWF4敲除突变体仅改变叶夹角而不影响株高和籽粒性状的研究一致。dwf4-abd有限的多效性效应提示该基因是培育适合高密度种植小麦理想株型的有前景靶点。SEM显示dwf1和dwf4突变体叶枕耳状突起区域细胞长度显著缩短，限制纵向伸长并阻止叶片偏离茎秆，这与水稻和玉米BR相关直立株型突变体的报道一致。dwf4-abd中整体BR水平无显著变化可能由于DWF4在叶枕中的组织特异性表达未被整体幼苗分析捕获，玉米lac1突变体在叶舌区域特异性降低6-deoxoCT和CS支持这一可能性。

结论：DWF1和DWF4功能缺失突变均赋予小麦直立冠层株型。然而，由于DWF1是BR合成途径早期催化24-MC转化为CR的唯一酶，其无效突变还导致株高、分蘖数和籽粒大小降低，这些多效性效应将限制dwf1功能缺失等位基因在作物改良中的应用。相比之下，dwf4无效等位基因赋予直立叶株型，仅轻度降低株高且不影响籽粒发育。因此，引入DWF4的自然或诱导等位变异可能是培育适合高密度种植条件小麦理想株型的有前景策略。