环状硅氧烷经口暴露风险评估：以八甲基环四硅氧烷（D4）为例的肾脏毒性证据整合与食品接触材料迁移参考值推导

《Archives of Toxicology》：Risk assessment of oral exposure to cyclic siloxanes – octamethylcyclotetrasiloxane (D4) as an example

　　

已发表的大鼠肾脏八甲基环四硅氧烷（D4）体内毒性数据被重新评估。结果表明，D4诱导肾脏效应的分子和生化作用模式（MOA）及其人类相关性尚缺失，仍是当前知识空白。肾脏重量增加（在恢复组中亦如此）被视为D4特异性不良效应。体外实验中，D4对人（HEK293、CaKi-1）和犬（MDCK）肾细胞系显示细胞毒性，而人肝细胞系HepG2未观察到毒性。低毒性剂量下的蛋白质组学分析采用KEGG通路分析显示，HEK293细胞中核糖体、t-RNA生物合成和碳代谢相关蛋白下调，提示主要细胞过程受到干扰。HepG2细胞中DNA复制受影响，但细胞活力未下降。根据大鼠慢性吸入D4后肾脏重量增加推导出基准剂量下限（BMDL₅）为84 ppm。采用标准因子将BMDL₅转换为口服每日耐受摄入量（TDI）0.21 mg/kg bw per day。该值对应适用于食品接触材料（FCM）的特定迁移参考值13 mg/kg food。由于缺少更高级环状硅氧烷低聚物数据，但预期毒理学特征相似，该参考值适用于D4至D13低聚物的加权和。基于已发表迁移和食品消费数据计算环状硅氧烷每日口服摄入量。总之，对硅胶食品接触材料进行后固化可降低D4及更高级低聚物的暴露，使其低于13 mg/kg food的特定迁移参考值。

该论文发表在《Archives of Toxicology》。研究背景方面，八甲基环四硅氧烷（D4，CAS 556-67-2）因广泛用于消费相关产品而存在经口、吸入和经皮等多途径暴露。硅胶食品接触材料（food contact materials, FCM）中的D4可在适宜条件下迁移至食品；Fromme等报道硅胶烘焙模具可使蛋糕边缘迁移0.46 mg/kg D4和超过19 mg/kg的环状十八甲基环九硅氧烷（D9），烘焙后厨房空气中D4和D7中位数分别为4 μg/m³和2.1 μg/m³。婴儿奶嘴首次使用可使3—36个月儿童经口摄入D4—D13达25—69 μg/kg bw/day，高于吸入暴露；长期使用预期更低。Zhu等显示硅胶烤盘可导致环状硅氧烷显著经口摄入。由于全氟和多氟烷基物质（PFAS）逐步淘汰，硅氧烷常作为替代物，德国烘焙纸中多数PFAS已被硅氧烷替代，预期经FCM的硅氧烷低聚物经口摄入将增加。慢性吸入D4可增加大鼠肝、肾、睾丸和子宫重量，并伴肝细胞肥大、慢性肾病和子宫内膜腺瘤等显微改变。Dekant等认为肾脏重量增加是大鼠特异性慢性进行性肾病（chronic progressive nephropathy, CPN）且无人类相关性；肝重量增加可能与环状硅氧烷裂解为线性结构并进一步代谢有关。Jean and Plotzke显示恢复组绝对肝重量处于正常范围，而慢性暴露后恢复组肾脏绝对和相对重量仍升高。当前知识空白在于D4诱导肾脏效应的分子和生化作用模式（mode of action, MOA）及其人类相关性缺失。研究人员因此重新评估D4大鼠肾脏体内毒性数据，结合人及犬肾、肝细胞系体外毒性和蛋白质组学，基于肾脏重量增加推导每日耐受摄入量（tolerable daily intake, TDI）和特定迁移参考值（specific migration reference value, SMR），再结合已发表迁移和食品消费数据估计每日经口暴露并进行风险评估。其意义在于为环状硅氧烷FCM暴露提供基于肾脏不良效应的健康指导值和迁移限值，并支持下述结论：后固化可降低D4及更高级低聚物暴露至SMR以下。

关键技术方法（≤250字）：研究人员重新评估Jean and Plotzke的Fischer 344大鼠24个月吸入D4毒性数据，并以EFSA网络工具/PROAST进行基准剂量（benchmark dose, BMD）分析；体外采用来自DSMZ的HEK293、CaKi-1、MDCK和HepG2细胞系，以D4/Poloxamer 188乳悬液处理，用噻唑蓝（MTT）法和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放测定细胞活力和细胞毒性；采用无标记定量（label-free quantification, LFQ）蛋白质组学、MaxQuant/Perseus处理和STRING数据库KEGG通路富集；按ECHA R.8进行途径间外推，并结合EFSA体重和食品消费假设计算TDI和SMR；结合已发表迁移数据及德国国家营养调查II消费数据估计经口暴露。

结果一：支持相关终点——肾脏毒性（Support of the relevant endpoint – kidney toxicity）。Jean and Plotzke显示Fischer 344大鼠24个月慢性吸入D4至700 ppm可显著增加绝对肝和肾脏重量，6个月吸入后血浆浓度达13 μg/ml；肝肿大被认为是由细胞色素P450等代谢酶诱导所致的适应性效应，肾脏绝对和相对重量增加则被解释为CPN。为检验D4肾脏效应是否仅与大鼠相关，研究人员以D4/Poloxamer乳悬液处理人肾HEK293、CaKi-1、犬肾MDCK和人肝HepG2细胞。HEK293细胞活力随D4/Poloxamer浓度增加而下降，LDH释放增加，提示膜稳定性受影响；CaKi-1出现类似效应；MDCK在低浓度出现活力增加、高浓度降至对照的50%，呈经典毒物兴奋效应，提示毒性并非仅由D4膜增溶等理化性质导致，而可能涉及细胞生理、信号通路或细胞器活性。相反，HepG2在高达50 mg/ml D4/Poloxamer下活力未受影响，人上皮细胞系HaCaT筛选亦未见毒性。由此得出结论：D4/Poloxamer对肾细胞系有毒，对其他器官细胞系影响较小，并对体内肾脏改变仅基于CPN的解释提出质疑。

结果二：D4/Poloxamer对不同细胞系蛋白质组的影响（Effects of D4/poloxamer on the proteome of different cell lines）。为支持D4对人肾细胞有毒而人肝细胞不敏感的假设，研究人员以亚毒性浓度D4处理HEK293、CaKi-1和HepG2细胞并进行蛋白质组学分析，共鉴定2640个可定量蛋白。HEK293细胞以5 mg/ml D4/Poloxamer处理24 h且活力保持在70%以上时，核糖体通路（hsa03010）中53个蛋白和氨基酰-tRNA生物合成通路（hsa00970）中12个蛋白下调，错误发现率很低；通路富集仅见于下调蛋白，上调蛋白未见富集。HepG2和CaKi-1在相似浓度下未见通路上调或下调。D4/Poloxamer增至10 mg/ml时，HEK293中蛋白生物合成相关通路下调；HepG2活力约90%时出现多条通路上调和下调。结论是D4影响肾细胞系中常与细胞分裂和蛋白合成相关的多条通路，而人肝细胞系在亚毒性剂量下受影响通路不同。

结果三：基于吸入暴露数据BMDL₅推导SMR（Derivation of a SMR, based on the BMDL5 of inhalative exposure data）。研究人员选择雄性大鼠慢性吸入D4后绝对肾脏重量增加作为最敏感效应推导TDI，该选择得到体外实验支持：D4对肾细胞系有毒而对HepG2无影响；体内雄性及雌性大鼠相对肾脏重量增加且在恢复组仍升高。按EFSA指南采用标准模型平均进行BMD建模，基准反应（benchmark response, BMR）选5%，得到雄性BMDL₅为83.8 ppm、雌性为86 ppm。将83.8 μmol/mol乘以D4分子量0.2966 mg/μmol并除以24 °C下1 mol空气体积0.02445 m³，得BMDL₅为1016.6 mg/m³；再纳入大鼠标准日呼吸体积1.15 m³/kg bw/day、每日6 h和每周5天暴露换算、大鼠与人类异速缩放因子4、吸入与经口吸收差异因子10、种间剩余差异因子2.5和种内差异因子10，计算TDI为0.21 mg/kg bw/day。按体重60 kg和每日接触相应FCM食品1 kg计算，SMR为13 mg/kg food。D5和D6也显示肾脏重量增加但效应剂量更高；D4、D5、D6肠道吸收分别约51.95%、16.9%/17.4%、11.88%/11.83%。由于D6以上低聚物缺乏实验吸收数据，研究人员用“五规则”和SwissADME定性预测，认为分子量高于1000 g/mol时肠道吸收可忽略，故仅D4至D13纳入组评估；并按D_n吸收=D4吸收×1/2^n?4（3n=4¹³ migration of D_n×1/2^n?4计算D4至D13迁移加权和，提出该值不应超过SMR 13 mg/kg food。该吸收估算未获D6以上实验验证，存在较高不确定性，但基于D4、D5、D6高吸收值及高聚物吸收显著较低，对消费者安全判断影响预期较低。

讨论部分总结：Jean and Plotzke认为慢性吸入D4后两性Fischer 344大鼠肾脏重量增加可能与治疗相关CPN严重度增加有关，并称该效应对人类无毒理学意义；但CPN为多因素、具增殖和退行性过程的疾病，Fischer 344和Sprague–Dawley较Wistar易感，特征形态包括肾小管嗜碱性、核拥挤和基底膜增厚。Jean and Plotzke未提供支持其结论的肾脏组织（免疫）组织学图像，也未纳入CPN相关蛋白尿、低白蛋白血症、肌酐和血尿素氮等尿液分析数据。其研究中700 ppm D4暴露12个月后雄性血清肌酐由0.91±0.07降至0.75±0.07 mg/dl、雌性由0.92±0.06降至0.78±0.04 mg/dl，与CPN预期相反；组织病理学未见非典型肾小管增生、肾小管腺瘤或癌。故肾脏效应似为物质相关而非大鼠特异性CPN。Andersen提出D4肾脏效应由CPN和D4线性硅氧烷代谢物诱导的α2u-球蛋白肾病（α2u-globulin nephropathy）共同导致；但D4体内迅速代谢为silanol而非siloxane，尚无发表证据显示线性silanol诱导α2u-球蛋白肾病，且α2u-球蛋白血症为雄性大鼠特异，不能解释雌性大鼠肾脏改变。美国环境保护署（EPA）指出不能完全排除加剧大鼠CPN的化学物亦加剧人类肾脏疾病过程，Jean and Plotzke关于大鼠特异且与人类无关的主张支持不足。Borgert等和Meeks等提出D4整合入细胞膜影响膜流动性和膜蛋白功能，尤其在300 ppm及以上；但Jean and Plotzke研究中雌性大鼠10 ppm D4暴露前3个月血清LDH由336±205升至562±113 U/L，后期未再检出，提示动物适应；本研究体外显示D4增加HEK293细胞LDH释放，而HepG2未见LDH释放增加，若仅为膜增溶的理化效应应在所有细胞系发生。Felix等显示D4对浆细胞瘤细胞系CRPC24、2–11和淋巴瘤细胞系CH12.LX有毒，30 μg/ml时三者活力降至70%，并诱导LDH释放，支持本研究HEK293数据。蛋白质组数据提示D4影响肾细胞系蛋白合成，HEK293中多条蛋白合成和DNA合成相关通路下调。主要局限是D4水溶性低（56 μg/l）、可水解、蒸气压高（124.5 Pa）、密度0.96 g cm^?3低于培养基，实际溶解浓度低于名义浓度，并可结合血清成分或容器壁；Poloxamer乳化虽成功产生剂量依赖性毒性，但有效剂量仍远高于Felix等，表明乳化并非最优，亟需低水溶性物质非毒性载体研究。总之，慢性D4暴露后肾脏重量增加尚无作用模式解释，且恢复组仍显著；体外实验显示D4对肾细胞有毒而肝细胞不受影响，故肾脏改变被判为不良效应并用于推导NOAEL。ECHA基于生育指数和平均活产仔数降低将D4分类为Repr. 2（H361f），US EPA 2025亦基于两代繁殖吸入研究将D4列为生殖毒性物，并认为低分子量高挥发性低聚物主要暴露途径为吸入，支持Fromme等和Eckardt等的数据；Eckardt等显示仅小部分挥发性环硅氧烷迁移入食品，多数在烘焙中释放入空气，但非后固化硅胶中低聚物浓度高，使D7等绝对迁移量较高，如短酥皮烘焙后达29.9 mg/kg。为降低硅胶FCM中其他潜在挥发性有机组分（volatile organic components, VOC）不确定性，BfR第XV号建议规定硅胶弹性体释放VOC不得超过0.5%；高温固化可降低包括环状硅氧烷在内的VOC至法规可接受量。D7至D13毒理学数据不足限制危害评价；in silico预测支持肠道吸收随低聚物增大而下降；吸收计算还受剂量和载体影响，高剂量下吸收趋近非线性饱和代谢，低剂量相对吸收更高；D4在玉米油、simethicone或纯品中肠道吸收分别为51.95%、12.11%和28.14%，玉米油可视为合理最坏情况。Eq. 4和Fig. 3S仅基于3个实验数据点及分子量增大吸收下降的一般趋势，不确定性显著，缺乏验证数据，但in silico数据总体支持；ADMETPredictor因含硅原子超出化学空间无法预测。迁移至Tenax或纯植物油等食品模拟物可能显著高估真实食品迁移，重复使用迁移随次数下降，第三使用循环可代表长期重复使用合理最坏情况。Eckardt等测得未固化硅胶向海绵蛋糕松饼和短酥皮迁移，按Eq. 5加权后D4—D13第一烘焙循环分别为8.0 mg/kg松饼和21 mg/kg酥皮，酥皮超过SMR 13 mg/kg food；第三循环仅1.5 mg/kg松饼和4.7 mg/kg酥皮，远低于SMR。以细烘焙食品为日常消费替代物，按德国国家营养调查II，细烘焙消费者每日消费95百分位青少年4.55 g/kg bw/day、成人3.29 g/kg bw/day，第一和第三循环D4—D13暴露分别0.026—0.096和0.005—0.021 mg/kg bw/day，均远低于TDI 0.21 mg/kg bw/day。Zhu等从未固化硅胶制品向80%砂和20% miglyol 812 N浆料迁移，第一和第三循环按Eq. 5加权分别为18.8和0.16 mg/kg，暴露0.0005—0.086 mg/kg bw/day，远低于TDI；其加拿大消费数据估计D4—D13暴露低于0.0001 mg/kg bw/day。故未固化硅胶首次迁移偶尔超过SMR，第三循环不超；任何人群均未超TDI，但迁移条件和其他暴露来源仍存不确定性；后固化硅胶第一循环迁移已更低，市场上多数硅胶制品经后固化，消费者D4—D13暴露预期很低。未来口服暴露可能增加，因PFAS限制和硅胶材料产量近年增5—6%，BfR亦注意到硅胶FCM增加。

研究结论部分翻译：八甲基环四硅氧烷（D4）的毒性已研究数十年，但迄今尚未建立具有说服力的作用模式（MOA）来解释D4对肾脏的细胞/分子效应及其人类相关性。由于存在多途径暴露，应建立D4和D5肾脏效应的作用模式。该研究显示，肾脏效应在雄性和雌性中均一致出现，因此应认为与人类相关。基于D4动物研究中的肾脏效应，推导出D4的每日耐受摄入量（TDI）为0.21 mg/kg bw/day，以及食品接触材料中D4至D13低聚物释放加权和的特定迁移参考值（SMR）为13 mg/kg food。将所述计算和参考值示例性应用于已发表迁移数据显示，未固化硅胶制品首次使用可能超过SMR，但长期使用不会超过。即使考虑首次使用迁移，任何人群均未超过TDI，因此不产生健康风险。尽管如此，食品接触应用仅应使用符合BfR关于硅胶第XV号建议要求的后固化硅胶FCM。后固化降低硅胶产品中残留低聚物（D4至D13总和小于0.1%），相应地，这些低聚物向食品的可能释放将远低于此处计算的SMR 13 mg/kg food。