化妆品成分毒性的机制通路：基于体外与体内证据的关键性综述

《Archives of Toxicology》：Mechanistic pathways of cosmetic ingredient toxicity: a critical review of in vitro and in vivo evidence

　　

每天，数十亿人使用含有数十种生物活性化合物的化妆品，这些化合物的联合毒理学特征从未被正式评估。人体生物监测证实，这些化合物在全球范围内沉积于血液、脂肪组织、胎盘和母乳中。本范围综述遵循PRISMA-ScR指南，综合了六大主要化妆品成分类别——防腐剂、紫外线（UV）滤光剂、工程纳米颗粒、香精、表面活性剂和着色剂——的体外与体内机制毒理学证据，并将研究发现映射至已建立的不良结局通路（Adverse Outcome Pathways, AOPs）。在PubMed/MEDLINE、Embase和Web of Science中的检索共识别出1231条记录，其中48项研究符合纳入标准。批判性评价揭示了三个结构性缺陷：大多数研究的测试浓度比真实皮肤暴露高出数个数量级；几乎所有研究均孤立评估单一成分；该领域过度依赖靶向检测而忽视非靶向组学技术。尽管如此，证据仍揭示了机制的趋同性：对羟基苯甲酸酯类（parabens）、二苯甲酮类（benzophenones）、UV滤光剂和表面活性剂激活重叠的雌激素受体、氧化应激和先天免疫通路，其生物学合理性得到队列数据的支持，这些数据将二苯甲酮-3（benzophenone-3）与睾酮水平降低及青春期发育时间改变相关联，并将防腐剂氯甲基异噻唑啉酮/甲基异噻唑啉酮（chloromethylisothiazolinone/methylisothiazolinone, CMIT/MIT）与Th2偏向的特应性反应相关联。AOP映射显示监管准备度不均衡：皮肤致敏（AOP40）是最成熟的通路；雌激素和雄激素受体活性（AOP29, AOP19）以及甲状腺干扰（AOP54）是需要完善的现有锚点；此外，本研究提出了三个候选AOP。研究人员提出了一项四层级、基本无动物的综合测试策略，该策略兼容欧盟法规1223/2009和美国《2022年化妆品现代化管理法案》（Modernization of Cosmetics Regulation Act of 2022），同时指出了六个优先研究空白，以指导未来化妆品成分的监管风险评估。

皮肤渗透与经皮吸收

三项物理化学规则决定一种成分是停留在皮肤表面还是进入血液循环：分子量低于500 Da、logP值介于1至4之间、以及低氢键供体计数均有利于渗透。对羟基苯甲酸酯类（parabens）（分子量152–194 Da，logP 1.96–3.57）易于穿过角质层，而高分子量聚合物则不能。表面活性剂从根本上改变了这一计算方式。十二烷基硫酸钠（sodium lauryl sulfate, SLS）与角质层的脂质双分子层相互作用，通过小角X射线散射（small-angle X-ray scattering, SAXS）和透射电子显微镜确认其可破坏脂质的层状相组织。在此过程中，它开辟了一条旁细胞通路，使得共同施加的内分泌活性化合物得以通过，这是单一成分风险评估无法检测到的。表面活性剂暴露优先从角质层中提取游离脂肪酸，其程度高于神经酰胺，这被认为会在清洁过程中损害屏障完整性。纳米颗粒的渗透几乎完全取决于途径。胶带剥离结合电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）证实，在正常使用条件下，大于20 nm的纳米TiO₂和纳米ZnO颗粒停留在完整皮肤的角质层内，但考虑到毛囊通路，情况令人担忧，因为颗粒可以积聚在毛囊中并滞留数天。一旦到达毛囊漏斗部，ZnO溶解，释放出游离的Zn²⁺离子，这些离子通过稳定同位素示踪技术用稀有⁶⁷Zn确认能够进入活性表皮。对于有机防腐剂和UV滤光剂，人体药代动力学数据令人警醒。氘标记的对羟基苯甲酸酯的药代动力学显示终末半衰期为9–12小时；关键的是，与等效口服剂量相比，皮肤暴露会产生不成比例的高浓度生物活性未结合型对羟基苯甲酸酯进入体循环，因为皮肤羧酸酯酶在吸收前未能完全水解酯类形式。因此，皮肤施用后到达靶组织的内分泌活性部分无法通过口服毒性数据预测——这是监管机构尚未正式解决的跨途径交叉参照中的一个根本性缺陷。

细胞毒性：从线粒体到炎症小体

化妆品成分诱导的细胞毒性并非单一事件，而是至少三种机制不同的通路的汇聚，标准监管检测将其孤立评估。内在（线粒体）凋亡通路在纳米颗粒中占主导地位。纳米ZnO和纳米TiO₂触发线粒体膜电位（Ψm）崩溃、细胞色素c释放、凋亡体组装和caspase-3/7激活，IC₅₀值在不同细胞类型间变化10–100倍。SLS主要通过坏死而非凋亡机制在原代角质形成细胞中诱导细胞毒性，在单层培养物中的IC₅₀值在0.001–0.002%范围内。甲基异噻唑啉酮（methylisothiazolinone, MI）代表了一种独特的、研究较少的途径：在皮层细胞中，其细胞毒性通过锌依赖性和ERK-MAPK依赖性通路进行，浓度为30–100 μM，独立于caspase激活，在更高剂量下产生坏死。MI在驻留型化妆品中的监管限制，是在该机制首次被表征十多年后才实施的，这是本综述所记录的从证据到监管滞后的典型案例。苯氧乙醇（phenoxyethanol）作为驻留型产品中对羟基苯甲酸酯的主要替代品，显示出截然不同的细胞毒性特征：只有在超过30 mM的浓度下才观察到显著的HaCaT活力降低和MMP-2介导的细胞外基质破坏，并且在人淋巴细胞中的遗传毒性测试确认在化妆品使用浓度下无显著DNA损伤。这种与异噻唑啉酮类的毒理学对比表明，并非所有对羟基苯甲酸酯的替代品都携带同等的机制风险。最令人担忧的细胞毒性机制是NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡（pyroptosis）。纳米TiO₂和纳米SiO₂通过嘌呤能和连接蛋白/泛连接蛋白信号传导在THP-1巨噬细胞和原代角质形成细胞中活化NLRP3，产生caspase-1依赖的成熟IL-1β和IL-1α，独立于吞噬作用。在经UVB照射的皮肤中，ZnO纳米颗粒加剧了这一反应：来自焦亡角质形成细胞的NLRP3负载外泌体以旁分泌扩增环的形式活化旁观者巨噬细胞。每天重复这一循环长达数十年的后果，正如防晒霜使用者所做的那样，目前完全未知。

氧化应激与Nrf2/Keap1/ARE轴

化妆品成分通过至少三种机制不同的途径产生活性氧物种（ROS），细胞对这些自由基的反应决定了结果是适应还是损伤。纳米TiO₂和纳米ZnO产生ROS；同时，溶解的Zn²⁺抑制线粒体复合物I和III，产生额外的超氧化物。香精化合物——柠檬烯（limonene）、芳樟醇（linalool）——经历大气自动氧化生成烯丙基氢过氧化物，这些物质通过在皮肤中直接发生均裂O–O键断裂而产生自由基。转录因子Nrf2是细胞的主抗氧化开关。在正常情况下，Keap1将Nrf2束缚住以便蛋白酶体降解；亲电性的化妆品成分修饰关键的Keap1半胱氨酸残基（C151, C273, C288），释放Nrf2以驱动通过抗氧化反应元件（antioxidant response elements, AREs）表达的细胞保护基因。使这条通路真正复杂且在监管上重要的是它的剂量依赖性。在KERTr角质形成细胞中，100 μM的肉桂醛（cinnamaldehyde）激活Nrf2并抑制促炎细胞因子；在250 μM时，Nrf2激活缺失，细胞保护性ARE基因诱导崩溃。这种抗氧化反应的剂量依赖性失败直接挑战了安全边际（Margin of Safety, MoS）框架关于单调剂量-反应关系的假设，并为后续章节描述的炎症后遗症奠定了基础。另一条通向Nrf2耗竭的平行途径是通过直接的谷胱甘肽（GSH）消耗。事实上，由SLS、MI和偶氮染料代谢物驱动的GSH消耗耗尽了Nrf2/Keap1/ARE轴的细胞保护能力，从适应性抗氧化反应跨越到氧化性损伤。当这与UV照射同时发生时，如在防晒霜使用中，二苯甲酮-3（benzophenone-3）的光解会生成自由基和彗星试验（comet assay）证实的DNA链断裂。

炎症：从NF-κB到NLRP3炎症小体

炎症是前述各节机制线索汇聚之处，也是其对慢性皮肤病的影响变得最为具体的地方。NF-κB是将皮肤刺激与促炎细胞因子产生联系起来的关键转录因子。SLS通过EGFR反式激活活化炎症。纳米颗粒通过一条独立的嘌呤能途径活化NLRP3炎症小体，产生caspase-1依赖的成熟IL-1β，并在UVB照射下放大为细胞焦亡和外泌体传播。防腐剂使用与特应性疾病之间最清晰的机制联系仍然是BALB/c CMIT/MIT模型：处理过的动物表现出经皮水分丢失（TEWL）升高、血清IgE升高、肥大细胞数量增加以及TSLP、IL-13、CCL17和CD4⁺IL-4⁺ T细胞群体的上调。这一级联反应——CMIT/MIT→屏障破坏→TSLP→Th2偏斜——在机制上将防腐剂选择与特应性皮炎易感性联系起来，并解释了从对羟基苯甲酸酯转向异噻唑啉酮类并非安全性改进，而是一种遗憾的替代。香精过敏原通过Cys和Lys残基上的共价半抗原-蛋白质加合物形成启动AOP-40定义的致敏作用。柠檬烯和芳樟醇的烯丙基氢过氧化物主要通过经典的Michael加成反应进行，而非通过自由基机制。这两种氢过氧化物之间差异致敏效力的机制表征已经提供。他们证明，在THP-1树突状细胞替代模型中，LINA-OOH是比LIMO-OOH更强的Nrf2激活剂，具有更大的GSH消耗、更强的p38 MAPK和pERK激活以及更高的CD54/CD86诱导（即监管致敏测试中使用的h-CLAT标志物）。这种机制效力差异直接预测了临床致敏率的差异：斑贴试验监测确认，在连续就诊的皮肤科患者中，柠檬烯氢过氧化物的致敏率为9.4%，芳樟醇氢过氧化物为11.7%。整合的直接肽反应性测定（DPRA）+ KeratinoSens + h-CLAT测试实现了约90%的预测人类皮肤致敏危害的准确性，并且Nrf2-ARE激活已被正式确立为AOP-40的关键事件2（KE2）。

遗传毒性与DNA损伤反应

化妆品成分的遗传毒性景观比标准监管测试所暗示的更令人担忧——不是因为危害必然很大，而是因为用于检测它们的工具存在已知的结构性盲区。纳米颗粒通过溶解的金属离子化学性质产生氧化性碱基损伤（8-羟基脱氧鸟苷，8-OHdG）和链断裂。一项高通量CometChip评估确认了ZnO和CuO纳米颗粒诱导剂量和时间依赖性的DNA链断裂，其中ZnO的遗传毒性主要归因于溶解的Zn²⁺离子。ZnO还激活p53通路：多项研究已确认磷酸化p53和p21/CDKN1A的诱导，而p53敲低可保护细胞免受ZnO介导的凋亡——这意味着如果p53功能受损，则存在致癌进展窗口。纳米TiO₂在真皮成纤维细胞中诱导γ-H2AX焦点（双链断裂标志物）并激活p53 Ser15磷酸化。对苯二胺（p-phenylenediamine, PPD）的遗传毒性证据比单一终点研究显示的更为复杂。研究表明，PPD被H₂O₂氧化会生成羟基自由基（通过电子自旋共振自旋捕获确认），在HaCaT角质形成细胞中产生细胞内ROS、8-OHdG形成和DNA链断裂；即使在低于化妆品监管最大值的H₂O₂浓度下也存在遗传毒性活性，这表明PPD+氧化剂组合在染发过程中是一种未被表征的遗传毒性风险。其他研究进一步证明，PPD单独即可诱导HaCaT细胞中的凋亡、γ-H2AX DNA损伤和NF-κB驱动的促炎信号传导，确立了PPD作为一种同时通过氧化、断裂和炎症途径作用的化合物。二苯甲酮-3是一种光遗传毒物，其危害对标准监管测试而言在结构上是不可见的。它在活的海葵中生成自由基和DNA断裂——但标准OECD检测组合中的Ames试验、微核试验和染色体畸变试验不包含UV照射步骤。因此，UV激活的遗传毒物的假阴性结果在结构上是保证会出现的。光彗星试验和光微核试验解决了这一空白，但仍未获得OECD验证——这是本综述确定的最紧迫的监管盲区之一。

内分泌干扰

对羟基苯甲酸酯类是表征最清楚的化妆品内分泌干扰物，理解它们为何受到监管以及被什么替代，对于论证遗憾替代至关重要。它们以比17β-雌二醇低10,000倍（丁酯，最强）到1,000,000倍（甲酯，最弱）的亲和力结合ERα和ERβ，然而在纳摩尔至微摩尔浓度下，它们激活ERE驱动的报告基因表达，刺激MCF-7乳腺癌细胞增殖，并上调ER响应基因，其效力随烷基链长度增加而增强。一项基于生物发光共振能量转移（BRET）的ERα二聚化测定在HEK293细胞中确认了所有四种常见对羟基苯甲酸酯的雌激素活性，而最近的两项研究显著扩展了对羟基苯甲酸酯内分泌干扰的证据基础。一项研究应用整合的转录组学和代谢组学对暴露于所有四种常见对羟基苯甲酸酯的成年斑马鱼进行研究，揭示了zfERβ2的激活以及酪氨酸、花生四烯酸和甘油磷脂代谢的紊乱——这些是类固醇激素生物合成所必需的代谢途径——并通过组织病理学确认了性腺发育受损。这种多组学方法首次应用于化妆品的对羟基苯甲酸酯体内研究，揭示了靶向终点测定无法看到的机制扰动。另一项研究证明，丙基对羟基苯甲酸酯（propylparaben）通过ROS介导的p53活化和颅面软骨细胞凋亡诱导斑马鱼胚胎的颅面发育毒性，这是一种完全独立于ER信号传导的机制，表型可通过ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）挽救，从而确认了因果通路特异性。除了雌激素活性外，微摩尔浓度的对羟基苯甲酸酯通过PPARγ驱动人脂肪来源干细胞的成脂分化，这是一条完全独立于ER信号传导的代谢内分泌干扰轴。化妆品成分内分泌干扰的机制证据得到了人类流行病学观察的印证，尽管并不完美。在美国国家健康与营养调查（NHANES）2011–2012队列中，尿液BP-3浓度与男性青少年（12–19岁）血清总睾酮水平显著降低相关，这与体外记录的雄激素受体（AR）拮抗作用一致。在乳腺癌与环境研究中心（BCERP）青春期队列中，较高的尿液BP-3与女孩的乳房初现年龄延迟和月经初潮推迟相关，提示BP-3的雌激素活性、抗雄激素活性和脂肪组织分布之间存在复杂的相互作用。在CHAMACOS纵向队列中，尿液甲基和丙基对羟基苯甲酸酯浓度与女孩青春期发育时间改变相关，与其体外和体内的雌激素活性大体一致。有三个重要的注意事项：横断面设计排除了因果推断；尿液生物标志物可能无法捕捉慢性共同暴露；且来自相关产品使用的残留混杂因素无法排除。尽管如此，跨独立队列的关联方向性与机制证据大体一致，为公众健康关注提供了生物学合理性。有机UV滤光剂同时扰乱多个激素轴。BP-3、BP-1、BP-2和BP-8下调甲状腺响应基因（Tshβ, Trhr, Trβ），并降低斑马鱼胚胎测定中的全身T4和T3。斑马鱼终生共同暴露于BP-3和纳米TiO₂产生了多代效应：F1后代显示出存活率下降、轴突生长受损、神经递质水平改变和T4降低。BP-2在口服治疗5天后对卵巢切除成年大鼠的多个器官表现出明确的雌激素激动效应，同时伴有甲状腺激素水平降低，与可能的甲状腺过氧化物酶抑制一致。研究确认了胡莫柳酯（homosalate）和4-甲基亚苄基樟脑（4-MBC）在PALM hAR报告细胞中具有强效体外抗雄激素活性，同时在E-Screen中具有雌激素活性。UV滤光剂类别的甲状腺干扰活性超出了二苯甲酮类，包括水杨酸酯类滤光剂。研究表明，胡莫柳酯在亚细胞毒性浓度下上调FRTL-5大鼠和人甲状腺细胞中的甲状腺球蛋白（thyroglobulin, Tg）和甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase, TPO）mRNA，确认了一种此前未在已验证的甲状腺特异性细胞模型中表征的UV滤光剂对AOP-54相关的甲状腺轴扰动。其他研究在斑马鱼幼体和H295R类固醇生成细胞中显示，阿伏苯宗（avobenzone）通过甲状腺受体依赖性机制降低T4并抑制运动，而胡莫柳酯同时发挥抗雄激素活性；混合物共同暴露产生加和性抗雄激素效应，说明UV滤光剂组合的同时多重受体干扰无法通过单一成分评估范式捕捉。

皮肤微生物组扰动

皮肤微生物组在化妆品毒理学中并非被动旁观者；它是一个活跃的生态系统，防腐剂和表面活性剂以其对皮肤屏障功能和免疫状态有直接影响的方式对其进行扰动。表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）产生抗菌的酚溶性调控素并维持酸性pH值以抑制金黄色葡萄球菌（S. aureus）的生长；痤疮皮肤杆菌（Cutibacterium acnes）将皮脂代谢为具有抗炎特性的短链脂肪酸。破坏这种生态平衡，即使在使用浓度范围内，也可能会使天平向病原菌优势倾斜。驻留型防腐剂，包括苯氧乙醇和甲基异噻唑啉酮，可能在配方浓度下1小时内完全消除表皮葡萄球菌，这种敏感性在机制上支持防腐剂诱导的特应性倾向。一项在3D LabSkin模型中对11种防腐剂的组合研究确认了对共生菌的差异性影响，确定了与共生相容和促进失调的组合；几种防腐剂还会上调微生物中的HDAC3，提示微生物组内存在表观遗传效应。在正常使用条件下进行的体内16S rRNA测序通过UniFrac分析确认，在非监管使用浓度下，经过防腐剂处理的皮肤部位与未经处理的皮肤部位之间无β多样性差异。重要的是，并非所有化妆品产品类型都同等程度地扰乱皮肤微生物组。一项研究发现，短期使用标准SPF 20防晒霜并未显著改变暴露于UV照射的人类志愿者皮肤微生物组的α或β多样性，仅低丰度属出现轻微的短暂波动；卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）受到UV滤光剂的选择性保护，免于UV诱导的减少。这一阴性结果具有监管相关性：它表明在同等暴露窗口下，标准施用剂量的UV滤光剂配方不会复制驻留型防腐剂的失调效应，支持在化妆品类别内区分特定于配方类型的微生物组风险。从表面活性剂诱导的角质层破坏，经过选择性病原菌富集，再到Th2偏向的免疫致敏这一机制链条，既有机制依据，又对现行监管框架而言是不可见的：没有一种单一成分、单一终点的评估范式旨在检测它。