扩展一代生殖毒性研究中肛殖距（AGD）与乳晕/乳头保留（NR）评估：对监管毒理学的启示

《Archives of Toxicology》：Evaluation of anogenital distance (AGD) and areola/nipple retention (NR) assessments in extended one generation reproductive toxicity studies - Implications for regulatory toxicology

　　

扩展一代生殖毒性试验（EOGRTS）代表当前体内生殖毒性测试的先进水平。尽管其主要目的是提供性功能和生育力信息，也可为评估化学物质的内分泌干扰效应提供重要信息。在欧洲化学品管理局（ECHA）与九个欧盟成员国的合作中，对EOGRTS进行了全面审查，以评估其在支持欧盟监管危害评估中的作用。在一个附属项目中，研究人员分析了肛殖距（AGD）和乳晕/乳头保留（NR）这两个评估内分泌干扰的关键且敏感终点的测量。来自72份完整研究报告（FSR）的所有F₁代子代均接受了AGD和NR检查。另有25个AGD数据集和21个NR数据集来自F₂代子代，最终共分析97个AGD数据集和93个NR数据集。在AGD数据评估中，评估以下因素：变异系数（CoV）、测量精度以及对照组雌雄AGD之间的重叠。63%的数据集显示良好或可接受的数据质量（即低CoV、足够测量精度以及雌雄AGD清晰分离）。12%显示有限数据质量，25%显示质量不足。开展研究的20家试验机构表现出参差的能力，约三分之一表现优异，三分之一结果混合，三分之一表现不佳。在乳晕保留数据集评估中，若一项研究所检查的任何雄性中均未见乳晕，则视为潜在局限性；同样，若对照雄性中观察到意外高数量的乳晕，也视为潜在局限性。令人意外的是，这些问题非常常见，在83%的数据集中被识别，这强调改进该终点评估指南的重要性。基于此审查，经济合作与发展组织（OECD）目前正在制定用于评估这两个终点的更新指南。解决已识别挑战对于提高EOGRTS的效用，并进而促进对暴露于内分泌干扰化学物相关潜在危害和风险的更知情决策至关重要。

研究背景方面，扩展一代生殖毒性试验（EOGRTS，用于综合评估生殖毒性和内分泌干扰的体内试验）是经济合作与发展组织（OECD）测试指南（TG）443所规定的当前先进方法，主要提供性功能与生育力信息，同时可评估化学物质的内分泌干扰效应。欧洲化学品管理局（ECHA）与九个欧盟成员国对2015—2020年间用于REACH注册的EOGRTS设计、实施、分析和报告进行了全面审查，并启动附属项目深入分析特定终点。肛殖距（AGD，肛门至生殖结节的距离）与乳晕/乳头保留（NR，雄性幼仔乳晕或乳头残留）是对产前雄激素信号干扰高度敏感的生物学标志，是内分泌干扰证据权重评估的重要信息来源，并已被纳入OECD多项测试指南的强制终点。若执行不熟练，可能影响监管结论，因此需要评估试验机构能力并优化方法。研究人员基于72份EOGRTS完整研究报告（FSR，完整研究总结报告）分析AGD和NR，匿名化试验机构信息，旨在提供技术建议并促进方法标准化。论文发表在《Archives of Toxicology》。该研究的重要意义在于识别AGD与NR评估中的方法学挑战，为OECD指南更新和监管危害评估的可靠性提供依据。

关键技术方法不超过250字：数据来源于72份EOGRTS的FSR，均为REACH注册相关研究，2015—2020年由合同研究组织（CROs）或化学品生产企业内部动物设施开展；F₁代全部纳入，25项研究含F₂代，其中NR的F₂数据集21个；最终纳入97个AGD数据集和93个NR数据集，涉及匿名化后的20家试验机构。研究人员将方法学信息及个体、窝均值、组均值结果提取至Excel数据库；AGD按测量精度、对照雄性CoV（变异系数，标准差/均值×100%）及雌雄分离程度评分1—5；NR按对照雄性背景发生率和暴露组识别情况评分1—5；并复核开放文献中77篇文献、147个数据集、28家机构的NR结果，采用同一评分体系。

研究结果如下。“EOGRTS中总体AGD和NR发现”：81个可评分AGD数据集中，63%为良好或可接受（40个良好、11个可接受），12%质量有限，25%质量不足；其中7个因测量精度不足评为4B，13个因高CoV且雌雄AGD分离不足评为4A。87个可评分NR数据集中，17%为良好或可接受（10个良好、5个可接受），83%为潜在可靠性有限；其中74%在任何雄性中均未见乳晕（评分3），9%对照雄性乳晕保留异常高（评分4，对照均值通常1.8—2.5）。“开展EOGRTS的不同测试机构的能力”：72项研究初为21家机构，因两家密切合作合并为20家；8家机构AGD评分持续为1或2，完成20/73项研究；6家仅得4A、4B和5，完成20/73项；6家结果混合，完成32/73项；12家开展超过1项研究的机构中，C、H、L表现良好且一致，K、J、I、B有限或较差。NR方面，4家机构出现评分1（K、N、B、C），其中K、N为100%；H、A出现评分2；C有超过50%研究为评分4；6/20家发现背景性乳晕保留，14/20家所有研究均为评分3。“基于EOGRTS数据库的附加分析”：多数AGD在出生后日（PND）0或1测量，17个数据集在PND 4测量；未见PND 4与出生后早期评估质量的明显差异，无法得出明确结论；AGD与NR的机构能力无清晰关联，机构研究数量与能力也无清晰关联。93个NR数据集中30个使用Sprague Dawley（SD）大鼠、63个使用Wistar大鼠；评分3在SD中占73%、Wistar中占67%，无明显差异；机构品系偏好分析未显示一致关系，C机构高乳晕发生率更可能与方法学程序有关而非品系效应。“已发表文献中的乳晕保留结果”：77篇文献中1篇因信息不足评5分，76篇来自28家机构；超过75%为良好或可接受（37篇评分1、22篇评分2），13%（10/76）评分4，仅9%（7/76）评分3，与EOGRTS中74%评分3形成明显对比。按资助来源，60篇公共资助、16篇私人资助；公共资助约60%评分1，私人资助12.5%；评分3在公共资助中占5%，私人资助中占25%；公共资助19家机构中10家多数或全部研究评分1，仅1家全部评分3；私人资助9家机构中3家全部评分3。

讨论部分总结：研究人员认为AGD评估总体质量尚可，但25%数据集质量不足，约三分之一机构表现优异、三分之一混合、三分之一持续不佳；雌雄分离不足和CoV偏高是重要问题，只有14/97个数据集CoV低于5%，且报告三位有效数字并不必然对应更高质量，二位有效数字已足够。AGD评估年龄方面，PND 4数据有限，无法就优势或劣势得出明确结论，指南建议暂不变。NR方面，多数机构潜在可靠性有限；74%数据集和70%机构未在任何雄性中识别乳晕，而开放文献仅9%无乳晕；Parker and Tyl白皮书报告对照SD雄性11—13日龄从未见保留乳头，但乳晕见于0—7.5%对照。研究人员强调，若无阳性或历史对照数据证明机构能识别乳晕，阴性结果可靠性存疑；更新后的TG 443要求报告支持试验可靠性和敏感性的数据。高背景乳晕保留若在单一机构多数数据集中出现，可能提示方法学不准确；盲法、评估者培训、标准操作程序（SOP）质量、评估时间和报告质量均可能影响结果；开放文献中盲法报告与较好NR评分存在一定关联，但分析不确定性较大。部分FSR仅提供是/否结果或仅提供窝均值，导致无法评分，强调遵循计数和个体数据报告方法的重要性。建议监管方要求试验机构在研究报告摘要中提供AGD测量精度、对照雄性CoV、雌雄重叠及乳晕识别细节，以支持证据权重分析。

研究结论部分译文：总之，所进行的分析表明，AGD测量已在大多数开展EOGRTS的试验机构中成功实施，而乳晕保留方法可能需要改进，因为大多数机构未按当前科学预期评估该终点。这引发对部分结果可靠性的担忧，因为能力不足的试验机构可能提供假阴性结果。因此，未来工作应集中于改进测量质量并确保机构内部和机构之间的一致性，以提高结果可靠性。可能影响结果质量的因素包括评估者盲法、评估者培训、SOP质量、时间分配和报告质量。展望未来，解决这些问题需要制定更稳健的指南以标准化评估，并确保一致性和严格培训。由于该附属项目获得的知识，TG 443的2025年更新规定AGD应以至少两位有效数字测量并以毫米报告；“乳晕保留”已替代“乳头保留”，更新后的结果部分要求报告是否采用盲法。GD 151也已更新，包括对活体评估盲法、减少评估者数量和改进技术培训的建议。通过共同解决这些因素，科学界可为生殖毒理学研究尤其是EOGRTS中AGD和乳晕保留更可靠和可重复的评估铺平道路。这些努力对于推进该领域并确保研究内分泌干扰的体内研究实验结局的有效性至关重要。