纳米化硫化氢释放型地塞米松衍生物（Dexa-TBZ）局部治疗银屑病的临床前评价

《Pharmaceutical Research》：Preclinical Evaluation of a Nanoformulated Hydrogen Sulfide-releasing Dexamethasone for Topical Treatment of Psoriasis

　　

目的：长期使用糖皮质激素（corticosteroids）相关的局部和全身不良反应促使研究人员探索银屑病（psoriasis）新的治疗策略。本研究在实验性银屑病模型中评价负载硫化氢（H₂S）释放型地塞米松衍生物（Dexa-TBZ）的新型纳米制剂（nanoformulation）的疗效。方法：采用局部咪喹莫特（imiquimod, IMQ）诱导银屑病，小鼠接受负载地塞米松（Dexa，对照）或Dexa-TBZ的纳米制剂治疗4天。通过改良银屑病面积和严重程度指数（Psoriasis Area Severity Index, PASI）评估红斑和鳞屑，检测髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）活性和脾脏大小以评价疗效。结果：每日局部治疗Dexa或Dexa-TBZ均减少鳞屑和红斑，其中红斑最可能与炎症减轻有关，MPO活性和中性粒细胞浸润显著降低支持这一点。两种治疗均减少表皮增厚，表明局部疗效相当。然而，Dexa导致循环白细胞和脾脏大小更大程度降低，提示尽管局部给药仍具有较高全身暴露。相反，Dexa-TBZ全身效应有限。结论：尽管Dexa-TBZ未显示更优局部疗效，但其较低全身影响提示安全性和耐受性改善，可能有利于银屑病等慢性疾病的长期局部治疗。

银屑病（psoriasis）是一种慢性免疫介导的炎症性皮肤病，全球患病率约3–4%，临床可见皮肤炎症、红色或变色鳞屑斑、瘙痒和/或皮肤疼痛，虽多数不危及生命，但常带来情感影响和社会隔离。皮肤因表面积大且易于接近，是药物给药的理想途径，尤其适用于银屑病等皮肤病。现有管理策略包括局部治疗、光疗以及糖皮质激素（corticosteroids）、免疫抑制化合物和生物制剂等全身药物；糖皮质激素最常用，但即使局部给药，长期使用仍可伴随毛细血管扩张、皮肤萎缩、下丘脑–垂体–肾上腺抑制和库欣综合征等局部及全身不良反应，限制治疗依从性并影响长期用药安全性。因此，需要新的补充治疗策略。研究人员此前开发了用于局部递送硫化氢（H₂S）释放型糖皮质激素的纳米制剂（nanoformulation），其中杂合分子Dexa-TBZ由抗炎糖皮质激素地塞米松（dexamethasone, Dexa）与H₂S供体4-羟基硫代苯甲酰胺（4-hydroxy-thiobenzamide）经琥珀酸酯连接臂化学偶联而成。H₂S是哺乳动物细胞经酶和非酶途径产生的气体递质，与炎症、瘙痒和伤害性状况的有益效应相关；银屑病患者产生的H₂S低于健康人，支持H₂S补充可能有益。优化的纳米制剂由分散纳米液滴（<1000 nm）和连续层状相稳定，层状相由磷脂酰胆碱在水包油纳米乳外部隔室自聚集形成，并作为纳米乳形成表面活性剂；纳米乳和层状相可促进亲脂药物皮肤递送。鉴于银屑病皮肤增厚，需采用渗透增强策略。该纳米制剂在离体条件下增加Dexa-TBZ进入活性皮肤层并保持分子完整性，在体内保持皮肤组织学结构并避免皮肤屏障功能改变。基于此，本研究旨在评价局部纳米化Dexa-TBZ在实验小鼠银屑病模型中的药理作用。研究人员采用IMQ诱导小鼠银屑病模型，比较等摩尔Dexa与Dexa-TBZ纳米制剂局部治疗4天的效果，得出Dexa-TBZ局部疗效与Dexa相当但全身效应较低的结论，提示其安全性和耐受性可能改善，对银屑病等需长期局部治疗的慢性疾病具有潜在意义。

主要关键技术方法（不超过250字）：研究人员采用雄性Balb/c小鼠（6–9周龄，来自当地动物饲养设施；圣保罗大学生物医学科学研究所动物护理与使用委员会批准，方案号67/2017）建立局部IMQ（5%乳膏，65 mg/日，背部皮肤和耳）诱导的银屑病模型，并于第2–5天以等摩尔Dexa或Dexa-TBZ纳米制剂局部治疗4天。纳米制剂通过磷脂酰胆碱-油相混合、载药、加入水相及表征（偏振光显微镜、动态光散射（dynamic light scattering, DLS）测定粒径、多分散指数（polydispersity index, PDI）和zeta电位）制备。疗效评价包括改良PASI评分（红斑、鳞屑）、耳厚度（棘层肥厚）、背侧皮肤苏木精–伊红（hematoxylin–eosin, H&E）组织学与表皮厚度、皮肤MPO活性、脾脏湿/干重及循环总白细胞计数。

研究结果如下。1. Nanoformulation Characteristics（纳米制剂特征）：通过偏振光显微镜和DLS表征含Dexa-TBZ或Dexa的纳米制剂，发现二者均为单相、低黏度、混浊/微乳光体系；偏振光显微镜可见少量小液滴及层状相特征性马尔他十字（Maltese crosses），支持液滴分散于层状相中的乳化系统形成。含Dexa-TBZ制剂呈双峰分布，平均流体动力学直径分别为81.7±6.9和625.3±80.1 nm，PDI为0.4，zeta电位为?12.6±2.5 mV；含Dexa对照制剂宏观和微观特征相似，平均直径分别为60.7±7.2和690.4±63.5 nm，PDI为0.4，zeta电位为?10.1±2.1 mV。结果表明载入Dexa-TBZ或Dexa未影响纳米制剂理化性质。2. Effect of the Nanoformulation on the Psoriatic Skin – Inflammatory Parameters（纳米制剂对银屑病皮肤炎症参数的影响）：通过改良PASI评分和耳厚度评估IMQ诱导小鼠，发现实验性银屑病诱导后小鼠背侧皮肤红斑和鳞屑进行性增加、耳增厚从第2或第3天开始；以曲线下面积（area under the curve, AUC）分析时，Dexa和Dexa-TBZ均显著减少棘层肥厚（以耳厚度增加评估）且程度相似；与未治疗银屑病组相比，Dexa或Dexa-TBZ治疗组红斑（P<0.001）和鳞屑（Dexa P<0.0001，Dexa-TBZ P=0.0003）均类似降低。结论为两种纳米制剂局部抗炎疗效相当。3. Histological Evaluation of the Dorsal Skin and Myeloperoxidase Activity (MPO)（背侧皮肤组织学评价与MPO活性）：通过H&E组织学和MPO活性检测，发现健康对照皮肤真皮和表皮无组织学改变；IMQ诱导银屑病出现棘层肥厚、角化过度、海绵水肿及表皮突延长等特征，背侧皮肤厚度较健康对照增加1.9倍，真皮细胞增多；Dexa或Dexa-TBZ治疗使表皮增厚分别减少1.4倍和1.5倍（P<0.0001），两者间无差异，表皮突和真皮细胞性更接近对照。未治疗银屑病动物MPO活性显著升高，Dexa和Dexa-TBZ均将其降至甚至低于健康动物水平，表明中性粒细胞浸润显著减少。4. Spleen and Blood Analysis（脾脏和血液分析）：通过脾脏重量和循环白细胞计数分析，发现IMQ诱导实验性银屑病出现脾肿大（1.6倍，P=0.001）；Dexa而非Dexa-TBZ显著降低该参数（1.5倍，P=0.0064）。各组干重变化约80%且相似，提示脾重增加可能不与水肿相关。未治疗银屑病组循环总白细胞计数显著增加2.2倍（P<0.0001）；Dexa治疗后显著降低1.4倍（P=0.034），Dexa-TBZ未降低。结果提示Dexa-TBZ全身效应较低。

讨论部分总结：研究人员结合既往研究指出，H₂S在炎症性皮肤病中具有作用基础。Mirandola et al.报道NaHS（一种快速H₂S供体）体外处理NCTC细胞可损害白细胞介素-17（interleukin-17, IL-17）和白细胞介素-22（IL-22）诱导的细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）激活，并在转录水平干扰白细胞介素-8（IL-8）表达；银屑病患者以NaHS溶液治疗1周可降低磷酸化ERK（pERK）表达及核定位并减少IL-8表达。研究人员此前显示全身或皮内给予H₂S供体可减少瘙痒及皮肤等结构急性炎症；Coavoy-Sanchez et al. (2023)报道地塞米松与不同H₂S供体偶联在2,4-二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB）诱导小鼠特应性皮炎模型中维持母体皮质激素疗效，但这些研究未采用旨在增加皮肤渗透的纳米制剂。本纳米制剂制备简单、可重复，载药未影响理化性质；多液滴群体和较高PDI为预期结果，因未采用高能方法降低液滴尺寸和多分散性，与显微镜下小液滴观察一致。IMQ模型可再现人银屑病皮肤表现，包括表皮改变、红斑和鳞屑；改良PASI评分评价红斑和脱屑。每日局部应用Dexa或Dexa-TBZ减少红斑，可能与皮肤MPO活性降低所反映的炎症减轻有关，提示H₂S供体部分未干扰母体Dexa局部抗炎疗效。表皮增厚和银色鳞屑与角质形成细胞过早成熟和不完全角化所致角化过度有关；IMQ处理动物第2天开始鳞屑增加并伴表皮厚度增加，Dexa和Dexa-TBZ类似减少这些体征，证实局部抗炎作用相当。然而Dexa全身效应更明显，表现为总血白细胞计数和脾肿大降低更显著。脾为次级淋巴器官，重量和大小增加与炎症相关；脾肿大不是人银屑病典型症状，但常见于此实验模型。这些观察与研究人员先前研究一致，即未能检测到Dexa-TBZ在Franz扩散池（Franz diffusion cells）受体相，支持其低经皮递送和较低全身可用性。药物理化特性影响皮肤渗透和经皮渗透；研究人员先前使用不同亲脂化合物观察到随logP（脂水分配系数）和分子量增加，皮肤深部渗透和经皮递送均降低；Dexa-TBZ分子量高1.6倍且估计logP高于Dexa，不是最佳渗透物，这支持开发纳米制剂改善Dexa-TBZ递送，也解释Dexa较Dexa-TBZ更明显经皮渗透及全身效应差异。Guo et al.显示含雌二醇递送系统达到最高皮肤递送和经皮递送时也产生最显著脾肿大效应；Thatikonda et al.开发脂质体凝胶使nimbolide体外6小时透皮超过40%，并在IMQ银屑病小鼠中较药物溶液减轻脾肿大。H₂S降低所连接药物不良反应的能力也见于其他抗炎药：H₂S释放非甾体抗炎分子可防止反复给药继发的胃和小肠明显损伤和出血，支持H₂S超越疗效改善的有益作用。Dexa-TBZ递送可能产生其他未研究药理效应：在皮炎模型中Coavoy-Sanchez证明Dexa-TBZ而非Dexa-ADT增加特应性皮炎小鼠皮肤内源性H₂S产生并增强谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase）活性；与Dexa不同，H₂S释放衍生物防止皮肤组织白细胞介素-4（IL-4）上调、蛋白硝化和羰基化，提示向Dexa添加H₂S释放部分（如TBZ）刺激皮肤抗氧化防御；此外H₂S释放衍生物治疗动物血糖保持不变，而Dexa不然；已知皮质激素干扰葡萄糖稳态多个方面，包括抑制肌肉和脂肪组织外周葡萄糖摄取和增加肝糖异生，给糖尿病患者带来额外风险。尽管较低全身效应与先前离体观察到的较低经皮渗透一致，目前发现未建立全身暴露与药理效应直接关系，需体内药代动力学研究确认。虽然银屑病和特应性皮炎病理生理特征不同，特应性皮炎模型中H₂S释放Dexa衍生物治疗后无血糖改变提示额外潜在优势，值得在银屑病模型研究。鉴于银屑病和其他慢性炎症性皮肤病长期治疗需要副作用最小和安全谱良好的药物，并假设局部疗效相当，Dexa-TBZ较弱全身效应使该杂合化合物成为有前景治疗候选；后续研究应探讨更高剂量和/或更频繁给药方案以建立安全条件下改善Dexa-TBZ疗效的治疗方案。研究结论翻译：本研究结果提供证据表明Dexa-TBZ相对于母体药物具有主要潜在优势：在脾肿大和白细胞计数降低方面具有更有利的全身效应谱。等摩尔浓度Dexa-TBZ和Dexa在缓解局部银屑病体征和控制组织学改变方面具有可比的高疗效，表明在本研究条件下H₂S连接既不阻碍也不增强局部抗炎效应。尽管未正式研究全身毒性，减轻全身暴露和不良全身效应为涉及糖皮质激素治疗慢性炎症性疾病的更安全长期治疗提供了有前景途径。