巨噬细胞来源GPNMB通过CD44/mTOR轴促进VEGF非依赖性血管新生并改善压力超负荷诱导的心功能障碍

《Journal of the American Heart Association》：Macrophage‐Derived Glycoprotein Nonmetastatic Melanoma Protein B Attenuates Cardiac Dysfunction by Promoting Vascular Endothelial Growth Factor‐Independent Angiogenesis

　　

背景：压力超负荷诱导的心力衰竭涉及适应不良性心脏重构和血管新生不足。基于血管内皮生长因子（VEGF）的治疗存在局限，提示需要识别替代性血管新生通路。糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B（GPNMB）是一种巨噬细胞分泌蛋白，参与组织修复，但其在压力超负荷诱导的心脏重构中的作用及其调节血管新生的潜力仍未知。方法：研究人员将髓系特异性Gpnmb敲除小鼠和对照小鼠接受横向主动脉缩窄（TAC），评估心功能、心脏重构和毛细血管密度。进行单细胞RNA测序以识别转录组变化。体外，研究人员用重组GPNMB处理人内皮细胞，以评估增殖、迁移和成管，并剖析潜在信号通路。利用腺相关病毒9型（AAV9）载体评估Gpnmb过表达的治疗潜力。结果：髓系Gpnmb缺失加重TAC诱导的心功能障碍、肥厚、纤维化和毛细血管稀疏。单细胞测序显示，髓系特异性Gpnmb敲除心脏中毛细血管内皮细胞群减少，并出现提示内皮功能障碍和代谢重编程的通路富集。机制上，GPNMB通过以CD44（GPNMB的已知受体）依赖方式激活雷帕霉素机制性靶蛋白（mTOR）通路，直接促进内皮细胞增殖、迁移和成管，且独立于VEGF信号。心脏特异性Gpnmb过表达可挽救血管新生、改善心功能并减轻TAC后的病理性重构。结论：巨噬细胞来源GPNMB是压力超负荷心脏适应的关键调节因子。体外机制研究支持，其可能通过CD44/mTOR轴促进不依赖VEGF的血管新生程序。GPNMB是以微血管稀疏为特征的心力衰竭的有前景治疗靶点。

一、研究背景与意义
心力衰竭是多种心血管疾病的终末阶段，压力超负荷（如高血压、主动脉瓣狭窄）可导致病理性心肌肥厚、间质纤维化和收缩功能进行性下降。冠状动脉微血管完整性是这一过程的关键但常被低估的环节：血管新生不足（毛细血管稀疏）不能满足肥厚心肌增加的氧需求，加重组织缺氧、促进纤维化沉积，并加速由代偿性肥厚向显性收缩功能障碍转变。VEGF（血管内皮生长因子）长期被视为血管新生的经典通路，但基于VEGF的心力衰竭治疗受到疗效有限、病理性血管新生、水肿、低血压及治疗抵抗等限制。因此，识别安全有效的VEGF非依赖性血管新生通路具有重要需求。心脏巨噬细胞，尤其修复表型巨噬细胞，位于心肌间质和血管周围龛，可通过旁分泌影响内皮行为与血管重构，但介导适应性、非VEGF依赖性血管新生的特定巨噬细胞来源介质仍不明确。GPNMB（糖蛋白非转移性黑色素瘤蛋白B）为I型跨膜蛋白，可经蛋白酶切割释放可溶性胞外域，参与细胞迁移、黏附和修复；其在心肌梗死和动脉粥样硬化中具有背景依赖性作用，但在纯血流动力学应激即压力超负荷诱导心脏重构中的作用尚未被探索。公共数据集提示GPNMB在衰竭人心脏和压力超负荷小鼠心脏中上调，但其功能后果、细胞靶点及对VEGF非依赖性血管新生的调节潜力仍属知识空白。因此，研究人员开展髓系特异性Gpnmb敲除、体外机制和AAV介导过表达研究，证明巨噬细胞来源GPNMB对压力应激下维持心功能和毛细血管密度必不可少，机制为可溶性GPNMB通过内皮细胞CD44受体激活mTOR（雷帕霉素机制性靶蛋白）通路，独立于VEGF信号，并显示AAV介导的心脏Gpnmb过表达可挽救血管新生、减轻病理性重构，从而揭示新的巨噬细胞-内皮通讯轴及心力衰竭治疗靶点。

二、关键技术方法
研究人员采用髓系特异性Gpnmb^MKO小鼠与Gpnmb^flox/flox（FLOX）对照，行TAC或假手术，并用超声心动图、组织学和免疫荧光评估心功能、重构及CD31⁺毛细血管密度；对TAC后1周和4周FLOX与MKO心脏进行单细胞RNA测序（每样本由3只小鼠混合）；以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和原代小鼠心脏微血管内皮细胞（MCMECs）进行增殖、迁移、成管及信号检测；并以AAV9-cTnT-Gpnmb进行心脏特异性过表达。样本来源：Gpnmb^flox/flox与Lyz2-Cre小鼠由南方科技大学药学院Haocheng Lu实验室惠赠；HUVECs购自广州欣源科技；MCMECs分离自6–8周龄雄性C57BL/6J小鼠；AAV由HanYi Biosciences制备。

三、研究结果
1. GPNMB在压力超负荷心脏中上调，髓系特异性缺失不改变基线心脏表型：通过人类蛋白组数据关联分析及野生型小鼠TAC后蛋白检测，发现TAC后心脏Gpnmb蛋白升高；通过Gpnmb^flox/flox与Lyz2-Cre杂交构建髓系特异性敲除小鼠，基线生长、心脏重量指数及超声结构功能与对照无显著差异。
2. 髓系Gpnmb缺失加重压力超负荷诱导的心功能障碍和重构：通过FLOX与MKO小鼠TAC或假手术及系列超声和组织学评估，发现MKO-TAC小鼠射血分数（EF）、缩短分数（FS）更低，左室收缩末容积和收缩期前壁厚度增加，心脏重量/胫骨长度比（HW/TL）及心脏重量/体重比升高，纤维化面积增加，心肌细胞横截面积增大且每视野心肌细胞数减少。
3. 单细胞RNA测序揭示髓系Gpnmb缺失改变心脏细胞组成并重塑内皮通路：通过对TAC后1周和4周FLOX与MKO心脏单细胞RNA测序，发现主要细胞类型存在但比例改变，MKO心脏毛细血管内皮细胞相对丰度降低；内皮细胞群基因集富集分析（GSEA）显示与内皮功能障碍、缺氧、炎症、代谢重编程及细胞周期相关通路富集。
4. 髓系Gpnmb缺失损害压力超负荷后心脏血管新生：通过CD31⁺免疫荧光定量毛细血管密度，发现MKO-TAC心脏在TAC后1周和4周毛细血管密度均低于FLOX-TAC，假手术条件下无基因型差异；早期损伤尤为明显，提示Gpnmb对早期血管重塑重要。
5. GPNMB通过CD44受体结合激活mTOR增强内皮细胞功能：通过HUVECs给予重组GPNMB，发现其剂量依赖性促进增殖、迁移和成管，并快速增加mTOR下游4EBP1（真核翻译起始因子4E结合蛋白1）磷酸化；mTOR抑制剂TORIN1消除上述效应，抗CD44中和抗体减弱GPNMB诱导的功能及4EBP1磷酸化。
6. GPNMB以不依赖VEGF信号的方式促进血管新生：通过HUVECs比较VEGF与GPNMB并联合VEGF中和抗体，发现VEGF促增殖、迁移和成管作用被抗VEGF消除，而GPNMB诱导的上述作用不受VEGF阻断影响。
7. AAV介导的Gpnmb过表达在体内通过mTOR激活减轻压力超负荷诱导的心功能障碍并促进血管新生：通过野生型小鼠预先给予AAV-Gpnmb或AAV-GFP后行TAC或假手术，发现AAV-Gpnmb提高心脏Gpnmb蛋白，改善EF/FS、降低左室收缩末容积和壁厚，减轻肥厚和纤维化，增加毛细血管密度及4EBP1磷酸化；该实验采用cTnT启动子使过表达限于心肌细胞，用于评估心肌微环境中Gpnmb的治疗充分性。
8. Gpnmb直接促进原代小鼠心脏微血管内皮细胞增殖和mTOR激活：通过分离MCMECs并给予Gpnmb，发现其增加细胞增殖并提高4EBP1磷酸化，从而在更接近生理的相关细胞中验证Gpnmb直接激活mTOR并促增殖。

四、讨论总结与研究结论翻译
讨论指出，本研究识别髓系表达GPNMB为压力超负荷诱导心功能障碍中的新型心脏保护因子，首次证明巨噬细胞来源GPNMB在慢性压力应激中维持心肌血管新生和心功能，且该保护作用由内皮细胞中VEGF非依赖性CD44/mTOR信号轴介导，揭示心脏巨噬细胞编排适应性血管重塑的先前未识别旁分泌机制。研究强调早期血管新生窗口的重要性：MKO小鼠TAC后1周即出现毛细血管密度下降，可能形成相对缺血缺氧微环境，促进促纤维化信号并破坏血管周围龛，进而加剧灌注不足和病理性重构；GPNMB介导的VEGF非依赖性血管新生在此早期阶段起关键“守门”作用。机制上，CD44阻断减弱GPNMB诱导的4EBP1磷酸化，AAV-Gpnmb在体内增强mTOR活性，支持CD44/mTORC1-4EBP1轴；VEGF中和不能抑制GPNMB效应，显示其转化意义。讨论还对比GPNMB在心肌梗死中经GPR39作用于心肌细胞、在动脉粥样硬化中于泡沫巨噬细胞内调节脂质处理，强调其背景依赖性。局限性包括：压力超负荷下上调Gpnmb的精确信号未定义；CD44的体内内皮特异性验证尚待完成，可能存在其他共受体或替代受体；GPNMB介导血管新生与其他心脏细胞类型的相对贡献需进一步研究；AAV采用cTnT启动子使过表达限于心肌细胞，不能直接恢复髓系来源，只证明增加心脏Gpnmb水平足以保护；组织裂解主要检测全长糖基化Gpnmb，未检测到可溶性胞外域可能与其快速脱落和扩散一致；人类心衰相关性仍需患者样本和模型验证。研究展望提出未来需在心力衰竭患者中验证该通路临床相关性，并在微血管稀疏心衰临床前模型评估靶向巨噬细胞GPNMB或给予重组GPNMB蛋白的治疗效果。
研究结论翻译：本研究确立巨噬细胞来源GPNMB是压力超负荷心脏适应的关键调节因子。研究人员证明髓系细胞中GPNMB缺失加重TAC后心功能障碍、肥厚、纤维化并损害血管新生。体外机制研究表明，可溶性GPNMB通过CD44受体结合激活内皮细胞中的mTOR通路，且不依赖VEGF信号；该通路可能构成其体内血管新生效应的基础。此外，心脏特异性Gpnmb过表达可挽救血管密度并减轻病理性重构。研究结果揭示了一个新的巨噬细胞-内皮旁分泌轴，并将GPNMB确定为以微血管功能不足为特征的心力衰竭的有前景治疗靶点。