《The Veterinary Journal》：A Novel PRRSV-2 M Antibody-Blocking ELISA Shows Superior Sensitivity Over N Antibody Assays for Evaluating Maternal Antibodies
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•新型PRRSV-2 M蛋白阻断ELISA具有高的灵敏度和特异性。•PRRSV-2 M蛋白阻断ELISA在检测母源抗体方面优于N蛋白检测法。•母源M抗体比N抗体持续时间更长、丰度更高。引言猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的高度传染
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新型PRRSV-2 M蛋白阻断ELISA具有高的灵敏度和特异性。
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PRRSV-2 M蛋白阻断ELISA在检测母源抗体方面优于N蛋白检测法。
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母源M抗体比N抗体持续时间更长、丰度更高。
引言
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的高度传染性的全球性传染病。该病以妊娠母猪繁殖障碍（如流产和死胎）以及仔猪和育肥猪出现严重呼吸道症状为特征，给养猪业带来持续的经济损失。PRRSV隶属于小病毒科，具有约15kb的单股正链RNA（+ssRNA）基因组。由于其广泛的遗传多样性，国际病毒分类委员会（ICTV）将PRRSV分为两个不同的种：PRRSV-1（欧洲型）和PRRSV-2（北美型），两者核苷酸同一性仅约为60%（Walker等，2021）。PRRSV-1进一步分为4个亚型，而PRRSV-2已分化为11个谱系，谱系间的遗传距离在11%至18%之间（Stadejek等，2013，Balka等，2018，Shi等，2010a，Shi等，2010b，Zhang等，2024）。
自1987年美国首次报告暴发以来，PRRSV已在全球范围内建立了地方性流行。PRRSV-1于1991年在荷兰分离到（Lelystad株），PRRSV-2于1992年在美国被鉴定（VR-2332株）（Terpstra等，1991，Benfield等，1992，Collins等，1992）。在中国，1996年分离并报告了第一个PRRSV毒株CH-1a（谱系8）（Guo等，1996），标志着该病毒在国内传播的开始。自2006年以来，中国陆续报告了多种PRRSV变异株（Han等，2009，Leng等，2012）。值得注意的是，高致病力PRRSV（HP-PRRSV，谱系8），以HuN4株为代表，其nsp2区域存在一段不连续的30个氨基酸缺失，可导致仔猪40%至100%的致死率（Tong等，2007）。此后，NADC30样（Zhao等，2015，Zhou等，2018）和NADC34样（Zhang等，2018，Xu等，2022）毒株（谱系1）以及谱系3毒株也在中国陆续出现（Yin等，2012，Lu等，2015）。因此，目前中国PRRSV的流行病学形势极为复杂，其特征是多个谱系共存，其中谱系1和谱系8占主导地位（Li等，2025，Tian，2017，Zhang等，2023）。
目前，PRRSV的防控主要依赖疫苗接种。然而，鉴于减毒活疫苗存在安全性顾虑，一些养猪企业已启动群体根除策略以应对PRRSV。最终目标是实现"双阴"状态——即养殖区域内所有猪的PRRSV抗原和抗体检测均为阴性。实现并维持双阴状态代表了养猪业的最高健康标准，可以显著提高生产效率。PRRSV根除计划的成功实施需要可靠的诊断方法作为支撑。在抗原检测方面，定量PCR（qPCR）的广泛应用已催生出高度灵敏的检测方法，能够在临床中快速准确地检测各种PRRSV毒株（Gong等，2025）。然而，抗原检测主要用于确认急性感染，无法反映历史感染状况，也无法评估疫苗接种后的体液免疫反应。
抗体检测弥补了这一空白。在血清学检测方法中，酶联免疫吸附试验（ELISA）仍是市场上最广泛接受的方法。由于核衣壳（N）蛋白特异性抗体在感染后早期即出现，商业化试剂盒通常以N蛋白为靶标（Lopez等，2007，Lopez和Osorio，2004），包括IDEXX、HIPRA和JNT生产的间接ELISA（Li等，2024）。此外，我们此前开发的基于N蛋白的阻断ELISA（N-B-ELISA）相比商业化试剂盒表现出更高的灵敏度（Li等，2024）。然而，N特异性抗体并不是最后消失的（通常在感染后17~18周开始下降）（Lunney等，2016）。针对某些非结构蛋白的抗体，如nsp1（α/β）、nsp2和nsp7（α/β），往往可以持续存在约20周（Lunney等，2016，de Lima等，2006）。因此，仅依赖N蛋白抗体进行PRRSV诊断可能引入诊断偏差，无法全面反映宿主的整体体液免疫。此外，膜蛋白（如GP5和M蛋白）是诱导中和抗体的功能靶标，其对应抗体水平与免疫保护密切相关（Luo等，2023，Trible等，2015）。
因此，建立针对其他PRRSV蛋白的抗体检测方法具有重要的诊断意义。在本研究中，我们利用M蛋白特异性单克隆抗体开发了一种新型针对PRRSV-2 M蛋白的阻断ELISA（M-B-ELISA）。在临床样本评估中，该检测方法表现出与商业化N蛋白试剂盒相当的灵敏度。更重要的是，在检测新生仔猪的母源抗体方面，M-B-ELISA表现出优于N蛋白检测法的灵敏度。通过利用M-B-ELISA、N-B-ELISA、商业化试剂盒和免疫荧光抗体法（IFA）系统追踪M和N母源抗体的动态变化，我们首次发现母源M抗体比N抗体持续时间更长且丰度更高。综上所述，本研究不仅丰富了PRRSV血清学的方法学工具箱，也为PRRSV根除计划提供了强有力的技术支持。
章节摘录
基于M蛋白的阻断ELISA（M-B-ELISA）的开发
抗PRRSV-2 M蛋白单克隆抗体（mAb）1C8此前已在我们实验室获得（Wang等，2014）。该抗体的纯化由金斯瑞生物科技（中国南京）完成。完整的PRRSV HuN4-F112病毒颗粒被用作包被抗原。简要制备流程如下：将Marc-145细胞以0.1的感染复数（MOI）感染HuN4-F112毒株。当约80%的细胞表现出细胞病变
M-B-ELISA的建立
通过棋盘滴定法确定包被抗原的最佳浓度为600 ng/孔。单克隆抗体（mAb）1C8的最佳工作浓度为1.27 ng/μL，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG以1:4000的比例稀释使用。详细的最优条件汇总于表1。最终确定的M-B-ELISA孵育流程如下：将二倍稀释的临床样本（100 μL/孔）加入板中
讨论
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的流行已给全球养猪业造成严重的经济损失。目前控制该疾病的主流策略主要包括疫苗接种和群体根除。此外，建立特异性强、灵敏度高且稳定的诊断方法对于有效防控PRRSV同样至关重要。在本研究中，我们开发了首个检测PRRSV-2 M蛋白抗体的阻断ELISA（M-B-ELISA）。在早期
结论
总之，本研究成功开发了一种灵敏且特异的阻断ELISA，用于检测PRRSV-2 M抗体。该方法在检测母源抗体方面表现出优于N抗体检测法的灵敏度。这一新型检测方法丰富了PRRSV检测的血清学工具箱，并为PRRSV根除计划提供了强有力的技术支持。
资金资助
本研究由国家自然科学基金（批准号32402920）和国家养猪产业技术体系创新基地（批准号：NCTIP-XD/C09）资助。
伦理声明
本研究经中国农业大学哈尔滨兽医学院动物伦理委员会批准，并按照动物伦理指南和已批准的方案执行。动物伦理委员会批准编号为260708-01-GR。
CRediT作者贡献声明
宋子玉：软件。张学丽：形式分析。王倩：论文写作 – 审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、形式分析、数据整理、概念构思。冯子轩：验证、监督、形式分析、数据整理。田志军：论文写作 – 审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取。郭振阳：论文写作 – 审阅与编辑、论文写作 – 初稿、可视化、验证、方法学、调查、形式
生成式人工智能及人工智能辅助技术在写作过程中的声明
在本工作准备过程中，使用了生成式人工智能辅助工具DeepSeek进行语言润色、语法纠错和文本可读性改进。作者已对AI生成的输出进行了全面审查和修改，并对手稿内容承担全部责任。未使用任何生成式人工智能工具来生成研究思路、进行数据分析、绘制图表或得出科学结论。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。未以任何形式获得与本文主题直接或间接相关的商业实体的任何利益。
致谢
本研究由国家自然科学基金（批准号32402920）和国家养猪产业技术体系创新基地（批准号：NCTIP-XD/C09）资助。
Zhenyang Guo|Zixuan Feng|Xueli Zhang|Ziyu Song|Jiahao Shi|Jinhao Li|Hongliang Zhang|Hu Xu|Jinmei Peng|Guohui Zhou|Tongqing An|Zhijun Tian|Qian Wang
