《Veterinary Microbiology》：A pilot study of tenofovir alafenamide fumarate as a promising therapeutic candidate for feline leukemia virus infection
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•TAF的代谢产物TFV-DP靶向猫白血病病毒（FeLV）逆转录酶，阻断病毒复制。•TAF表现出剂量依赖性的抗FeLV活性，EC50为284.1 nM，且细胞毒性低、安全性高。•口服给予TAF可剂量依赖性地降低FeLV载量/排毒，改善FeLV感染猫的存活
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TAF的代谢产物TFV-DP靶向猫白血病病毒（FeLV）逆转录酶，阻断病毒复制。
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TAF表现出剂量依赖性的抗FeLV活性，EC50为284.1 nM，且细胞毒性低、安全性高。
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口服给予TAF可剂量依赖性地降低FeLV载量/排毒，改善FeLV感染猫的存活率。
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TAF是治疗FeLV的安全且有前景的临床候选药物，为猫反转录病毒的合理用药提供了可行的药物再利用策略。
引言
猫白血病病毒（FeLV）隶属于反转录病毒科（Retroviridae）、正反转录病毒亚科（Orthoretrovirinae）、γ反转录病毒属（Gammaretrovirus）。它是家猫的主要病原体之一，可导致免疫功能缺陷、造血功能障碍、恶性淋巴瘤及全身性器官损伤（Shelton等，1990）。该病毒在全球范围内广泛分布，据估计感染约1.9%至30%的流浪猫及多猫家庭中的猫只（Bande等，2014；Giselbrecht等，2023；Luckman和Gates，2017）。其主要传播途径为水平传播，通过唾液、血液及黏膜分泌物传播（Lutz等，2009；Nesina等，2015）。病毒进入宿主后，靶向淋巴细胞和单核吞噬细胞系统，快速复制并整合入宿主基因组，导致持续性感染（Cattori等，2008；Jarrett，1999；Hartmann和Hofmann-Lehmann，2020）。感染后果往往十分严重：免疫抑制、再生障碍性贫血及淋巴增殖性疾病，均导致高死亡率和不良预后。目前FeLV的管理策略尚不充分，使感染动物面临严重的健康与福利风险（Jarrett等，1964；Willett和Hosie，2013；Hartmann，2012；Hartmann和Hofmann-Lehmann，2020）。
目前的管理手段依赖于疫苗接种、隔离、对症支持治疗和免疫调节。然而，仍缺乏作用机制明确、安全且适合长期口服的抗病毒药物。多种核苷类逆转录酶抑制剂，如齐多夫定（AZT），已在临床上尝试用于抑制FeLV复制（Zeidner等，1990；Zeidner等，1993）。然而，AZT常引起骨髓抑制，加重贫血，并损伤肝肾功能——这些问题导致长期耐受性差、临床效果不佳（Haschek等，1990）。重组干扰素omega及其他药物仅能缓解临床症状，并不能阻断病毒复制或阻止疾病进展（Weiss等，1991）。类似地，整合酶抑制剂如拉替雷韦（raltegravir）在体内的抗病毒疗效不一致：尽管拉替雷韦在体外可减少FeLV复制（Cattori等，2011），且在猫中耐受性良好（Boesch等，2015），但在进行性感染猫的临床研究中未能显示出一致的生存获益或持续的病毒抑制作用，不推荐其作为单药治疗（Westman等，2024；Boesch等，2015）。鉴于上述情况，利用现有药物开发高效、低毒、靶向特异性抗FeLV药物已成为兽医传染病研究的紧迫任务。
鉴于猫白血病病毒（FeLV）与人免疫缺陷病毒（HIV）在复制机制上具有相对较高的保守性（Auwerx等，2002；Coté和Roth，2008；Operario等，2005；Galilee和Alian，2018；Cattori等，2011），我们对临床上已批准的HIV治疗药物进行了分子筛选，优先选择疗效明确、安全性良好的药物。由替诺福韦前药丙酚替诺福韦（TAF）和富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF）衍生的活性代谢产物替诺福韦二磷酸酯（TFV-DP），被鉴定为靶向FeLV逆转录酶的潜在抑制剂。替诺福韦是一种经典的无环核苷磷酸盐类逆转录酶抑制剂，在细胞内被激活后可竞争性阻断病毒DNA链延伸。它对HIV和乙型肝炎病毒（HBV）具有广谱活性，耐药屏障高，已成为人类抗病毒治疗的基石药物（Gazzard，2001；Miller等，2001；Celum和Baeten，2012；Butt，2006）。然而，替诺福韦本身极性高、膜通透性差、口服生物利用度低，导致全身暴露量高，存在肾毒性和骨骼损害风险，这些问题限制了其在慢性感染中的应用。早期的体外研究仅报道了替诺福韦微弱的抗FeLV活性，这很可能与其生物利用度差有关（Greggs等，2012；Azanza等，2008；Pribut等，2021）。
为克服上述不足，随后开发了两种前药——TDF和TAF。二者在药代动力学、组织分布和安全性方面存在显著差异。TDF作为第一代前药，改善了口服生物利用度，已被证明可在体外和体内抑制猫免疫缺陷病毒（FIV）（Kim等，2023）。值得注意的是，替诺福韦还被证明可在体外抑制异嗜性小鼠白血病相关反转录病毒（XMRV）的复制，XMRV同属γ反转录病毒（Singh等，2010），这进一步支持了替诺福韦前药对抗FeLV的再利用潜力。但TDF在血浆中可被迅速水解，仍存在全身暴露量高及残余肾毒性和骨骼风险的问题（Kearney等，2004；Gallant和Deresinski，2003；Yang等，2025）。TAF作为第二代前药，相比TDF具有更高的血浆稳定性、优先的细胞内激活特性、更低的全身暴露量，以及显著降低的肾脏、肝脏和骨骼毒性。TAF可轻松进入淋巴细胞等易感细胞，并在细胞内被激活。因此，TAF已成为人类慢性病毒感染的一线治疗药物（Yang等，2025；Zhou等，2025；Di Perri，2021）。由于FIV和FeLV均为猫反转录病毒，复制机制高度同源，我们通过体外实验评估了TDF和TAF的抗FeLV活性及其对细胞的细胞毒作用。
本研究通过分子对接和体外验证证实，TDF和TAF均可抑制FeLV的增殖与感染。鉴于亲本替诺福韦生物利用度差以及TDF存在的安全性局限，本研究选择TAF进行体内评估。我们系统评估了其对病毒载量、临床症状、血液学、生化学及药代动力学的影响。本研究的目标是确定一种作用机制明确、安全且具有临床转化潜力的抗FeLV感染候选药物，同时为猫反转录病毒疾病建立可重复、高效的药物开发流程。
各章节摘要
病毒、细胞及实验动物
FeLV KT-FeLV毒株购自ATCC。猫肾成纤维细胞（F81）在含10%胎牛血清（FBS，Gibco，美国）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基（Gibco，美国）中培养，并在细胞培养箱（Thermo，美国）中于37 ℃、5% CO?条件下维持。实验动物为4至5月龄无特定病原体（SPF）家猫，经确认FeLV抗原和抗体均为阴性。猫只单独饲养于负压隔离环境中。
TFV-DP通过靶向结合FeLV-RT抑制病毒增殖
在TAF和TDF对抗人体反转录病毒的作用机制的指引下，我们系统表征了TFV-DP与FeLV逆转录酶之间的分子相互作用。首先预测了FeLV逆转录酶的二级拓扑结构和三级结构（图1A和B）。分子对接结果显示，TFV-DP占据了FeLV逆转录酶指状结构域和掌状结构域之间的正电荷结合口袋（图1C），并与之形成氢键。
讨论
TFV-DP作为竞争性核苷类逆转录酶抑制剂，终止病毒DNA链延伸并阻断FeLV复制。分子对接和分子动力学模拟显示，TFV-DP适配于FeLV-RT的活性口袋，在此处阻断底物掺入并停止DNA链延伸。具体而言，分子对接的结合自由能为-6.4 kcal/mol，虽然处于中等亲和力范围内，但复合物的结合自由能。
伦理声明
所有动物实验均按照华中农业大学动物管理与伦理委员会批准的方案（HZAUCA-2026-0012）进行。尽一切努力减少动物痛苦并减少动物使用数量。
作者贡献声明（CRediT）
熊俊尧： 监督指导，基金获取。李秋远： 监督指导，基金获取。斯友慧： 撰写——审阅与编辑，监督指导，基金获取。曹胜波： 撰写——审阅与编辑，监督指导，资源提供，项目管理，概念构思。李伟辉： 撰写——初稿，调查研究，形式分析，数据整理。严全辉： 软件，方法学，数据整理。彭佳佳： 撰写——初稿，方法学，数据整理。李璐颖： 方法学，
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究工作的已知经济利益冲突或个人关系。
致谢
本研究由中国国家重点研发计划（项目编号：2023YFD1800302和2025YFD1800400）和中央高校基本科研业务费专项资金（项目编号：2662026DKPY005）资助。
利益冲突声明
本文作者中没有任何人与其他人或组织存在可能不当影响或偏袒本文内容的经济或个人关系。
李伟辉｜严全辉｜彭佳佳｜李璐颖｜张燕｜叶子君｜熊俊尧｜李秋远｜斯友慧｜曹胜波
