病理学与分子证据揭示Pasteurella multocida在育肥羔羊呼吸道疾病及肺病变严重程度中的作用

《The Veterinary Journal》：Pathological and molecular evidence for the role of Pasteurella multocida in respiratory disease of lambs

　　

Pasteurella multocida是一种与羊呼吸道疾病相关的机会性病原体，但其相关性尚未完全明确。本研究旨在通过整合病理学与分子学方法，探讨P. multocida与肺病变之间的关联。研究人员在西班牙南部开展了一项比较性横断面研究，使用201份于冬季和夏季从外观健康的育肥羔羊（50–60日龄）采集的肺样本。本研究旨在对育肥羔羊的肺病变进行分子表征，并评估其与P. multocida分离株的荚膜型、脂多糖（LPS）血清型、毒力相关基因（VAGs）和序列型（STs）的关联。在48.8%的动物中鉴定出不同级别（I–III）的支气管肺炎病变。闭塞性细支气管炎（bronchiolitis obliterans）是一种在育肥羔羊中认识不足的慢性病变，在27.36%的肺中检出，其中大多数与弥漫性支气管肺炎相关（81.8%）。季节变化与病变严重程度和闭塞性细支气管炎显著相关，二者在夏季均更常发生。在201份分析样本中，17.41%分离出P. multocida，其存在与III型支气管肺炎风险增加相关（比值比（OR）=2.46，95%置信区间（CI）：1.10–5.51，p=0.029）。鉴定出3种荚膜型和2种LPS血清型，其中D:L3和A:L3血清群在弥漫性支气管肺炎和闭塞性细支气管炎中更常检出。鉴定出8种VAGs谱，尽管未能证明其与病变严重程度相关。在P. multocida分离株中观察到高度遗传异质性（20个STs；遗传多样性（GD）为0.93）。结果表明，P. multocida分离与支气管肺炎严重病例显著相关，而季节性也可能促成肺病变严重程度的差异。

研究背景：呼吸道疾病是小反刍动物生产中常见且具有重要经济意义的健康问题，可通过影响生长、饲料效率和福利降低生产力，并增加治疗成本和屠宰损失。肺炎常表现为肺前腹侧叶实变，多在屠宰场发现，因为仅约四分之一的受影响动物出现临床症状。已报道的大体病变包括以支气管肺炎为主要病变模式、肺前腹侧实变、弥漫性肺斑驳以及化脓性或纤维素性肺炎。P. multocida是一种广泛存在的革兰阴性球杆菌，也是上呼吸道共生菌，与育肥羔羊严重肺炎病例相关。既往研究描述了多种细菌（包括Mannheimia haemolytica、Mesomycoplasma ovipneumoniae和P. multocida等）在羊呼吸道疾病中共享的病变模式，但P. multocida分离株特征在病变严重程度中的具体作用仍认识不足。其致病性由多种毒力因子介导，其中荚膜和脂多糖（LPS）使细菌能够侵袭、逃避免疫反应并造成严重炎症损伤；其他毒力因子包括皮肤坏死毒素（toxA）、铁获取蛋白（hgbB）、外膜蛋白（OMPs）、丝状血凝素（pfhA）和黏附素（ptfA）等。基于血清学的荚膜型和外膜LPS结构可将P. multocida分为5种荚膜型（A、B、D、E和F）及8种LPS血清型（L1–L8），但此类表型分型对高度多样的P. multocida区分度低于分子分型；多位点序列分型（MLST）和VAGs检测已广泛用于临床分离株的流行病学和遗传特征分析。本研究旨在对屠宰羔羊中获得的P. multocida分离株进行分子表征，并将荚膜型、LPS血清群、VAGs和STs与肺组织病理病变相关联，以促进对P. multocida在羊呼吸道疾病中作用的理解。

研究人员开展了一项比较性横断面研究，于西班牙南部一商业屠宰场采集201份外观健康、50–60日龄育肥羔羊肺样本，冬季104份、夏季97份；通过宏观病理检查、苏木精-伊红（H&E）组织病理半定量评分和Masson三色染色评估肺病变，通过细菌培养、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和kmt1基因实时定量PCR（qPCR）鉴定P. multocida，通过PCR检测荚膜型、LPS血清型和VAGs，通过MLST（7个管家基因）及系统发育分析进行分子分型，并采用二元logistic回归评估季节和P. multocida分离状态与弥漫性支气管肺炎及闭塞性细支气管炎的关联。研究得出，P. multocida分离与III型支气管肺炎及闭塞性细支气管炎风险增加相关，夏季肺病变更严重，且首次在小于60日龄育肥羔羊中描述闭塞性细支气管炎；这些发现有助于理解P. multocida在羔羊呼吸道疾病中的作用，并强调整合病理学、微生物学和分子学方法的价值。

研究结果：
（一）组织病理学分析（Histopathological analysis）。通过宏观检查、H&E染色和半定量评分（两名病理学家盲法评估，199/201例评分一致，99.0%）发现，201份肺中仅20份（9.9%）无病变；支气管肺炎（bronchopneumonia，肺组织炎症并实变）为最主要病变，见于98份（48.8%），其中I型6份（3.0%）、II型12份（6.0%）、III型80份（39.8%）。其他早期呼吸道病变如卡他性支气管炎、慢性胸膜炎和支气管相关淋巴组织（BALT）增生见于77份（38.3%）。闭塞性细支气管炎（bronchiolitis obliterans，细支气管壁慢性炎症及纤维组织增生导致管腔阻塞）见于55份（27.4%），其中45份（81.8%）与III型支气管肺炎相关；Masson三色染色证实增殖病变内存在结缔组织。季节分析显示，夏季III型支气管肺炎风险显著高于冬季（OR=4.59，95% CI：2.46–8.56，p<0.001），夏季闭塞性细支气管炎风险亦显著高于冬季（OR=3.30，95% CI：1.67–6.53，p<0.001）。

（二）P. multocida分离株（P. multocida isolates）。通过细菌培养、MALDI-TOF MS和kmt1 qPCR确认，201份肺中35份（17.4%）分离出P. multocida，冬季10份（9.6%）、夏季25份（25.8%）。35份阳性动物中，22份（62.9%）为III型支气管肺炎，3份（8.6%）为II型；P. multocida阳性动物发生III型支气管肺炎的 odds 高于阴性动物（OR=2.46，95% CI：1.10–5.51，p=0.029），发生闭塞性细支气管炎的 odds 亦更高（OR=2.57，95% CI：1.17–5.64，p=0.019）；17份（48.6%）阳性病例见闭塞性细支气管炎，其中16份（94.1%）与III型支气管肺炎同时出现。荚膜分型鉴定出3种荚膜型，A型最常见（48.5%），D型和F型分别占28.6%和22.9%；LPS分型鉴定出L3（74.3%）和L4（25.7%）两种基因型；组合后D:L3（28.6%）和A:L4（25.7%）最常见，A:L3和F:L3各占22.9%。VAGs检测显示，7株（20.0%）不携带所评估的VAGs，toxA检出18株（51.4%），其他4种VAGs检出率为22.8%–48.6%；共鉴定出8种VAGs谱，但未能证明其与病变严重程度相关。MLST将35株分为20个STs，遗传多样性（GD）为0.93；最常见为ST9（20.0%）、ST95（17.14%）和ST324（11.43%），其余17个STs各占2.86%–5.71%，42.9%的分离株属于本研究鉴定出的新型STs。

（三）P. multocida荚膜-LPS、VAG谱、STs与病变严重程度的关联（Association between P. multocida capsular-LPS and VAG profiles, STs and lesion severity）。通过MLST系统发育分析（邻接法；最大似然法获得相似拓扑）发现，分离株分为Group A（包括所有A和D分离株）和Group B（包括F分离株），Group A又分为A1和A2；Group A1中两种VAG谱占96.5%（toxA+/ptfA-/ompH-/hgbB-/pfhA-占52.9%，toxA-/ptfA-/ompH-/hgbB-/pfhA-占41.2%），Group A2中80%为toxA+/ompH+/ptfA+/hgbB-/pfhA-，Group B全部为toxA-/ompH+/ptfA-/hgbB+/pfhA+。A:L3和D:L3分离株中III型支气管肺炎分别占75.0%和80.0%，且在闭塞性细支气管炎病例中分别检出62.5%和50.0%；A:L4仅半数与III型支气管肺炎及闭塞性细支气管炎相关。按ST与荚膜-LPS组合，ST9-F:L3分离株中III型占42.9%、II型占14.3%，1例见慢性胸膜炎；ST95-D:L3中III型占83.3%、II型占16.7%；ST324-A:L3全部表现为III型支气管肺炎。上述结果表明，特定荚膜-LPS基因型组合可能与病变严重程度差异相关，但未发现某一特定遗传群优先与更严重病变相关。

讨论部分总结：肺病变在屠宰时外观健康羔羊中常见，组织病理学检查对理解疾病发病机制重要，但定性描述不适合组间比较。本研究在商业屠宰场跨季节采样，发现不同级别支气管肺炎病变见于48.8%的动物，III型为主；首次在小于60日龄育肥羔羊中报道闭塞性细支气管炎，其与III型支气管肺炎相关。夏季III型支气管肺炎和闭塞性细支气管炎发生率显著更高，提示环境和管理相关因素可能影响病变严重程度。P. multocida分离与更严重、更广泛的肺病变相关；荚膜和LPS是重要毒力决定因素，A:L3和D:L3与III型支气管肺炎及闭塞性细支气管炎关系更密切，toxA在A:L3和A:L4中常见，而D:L3多缺乏toxA；但VAGs不能完全解释病变严重程度，需更全面的基因组方法如全基因组测序（WGS）进一步识别遗传决定因素。MLST显示分离株高度遗传异质性，ST9、ST95和ST324既往已在羊肺炎分离株中报道，新型STs中部分与ST95系统发育关系密切；ST95和ST324目前仅见于肺炎羊分离株，可能提示宿主适应。研究局限性包括单屠宰场采样可能存在选择偏倚、未纳入其他微生物和混合感染、屠宰时缺乏农场来源和管理等个体层面信息。研究结论（翻译）：综上所述，本研究为屠宰时外观健康动物中P. multocida与肺病变的关联提供了新见解；首次在小于60日龄育肥羔羊中描述闭塞性细支气管炎，该病变与夏季季节和严重支气管肺炎显著相关；然而，其与其他风险因素的关系以及对生长动物的潜在影响尚不能确定，仍需进一步研究以阐明其在羔羊中的病理学和临床意义。总之，这些发现有助于更好地理解羊呼吸道疾病，并强调整合病理学、微生物学和分子学方法的价值。