没食子酸对猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗病毒活性及转录组学鉴定 TNFAIP3 为候选促病毒宿主因子

《Virology》：Antiviral activity of tannic acid against porcine reproductive and respiratory syndrome virus and transcriptomic identification of TNFAIP3 as a candidate proviral host factor

摘要 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）给全球养猪业造成了巨大的经济损失。鉴于病毒多样性广泛且现有疫苗的异源交叉保护力有限，迫切需要开发对多种PRRSV毒株具有广谱活性的抗病毒策略。本研究调查了植物源性多酚——单宁酸（TA）的抗PRRSV活性。TA在MARC-145细胞（半最大抑制浓度[IC50] = 5.34 μM；选择性指数[SI] = 12.59）和原代猪肺泡巨噬细胞（IC50 = 4.22 μM；SI = 42.65）中均能强力抑制PRRSV复制，并对多个PRRSV-2谱系表现出广泛的抑制活性。作用机制实验表明，TA主要发挥病毒杀灭作用和进入后抑制作用。基于RNA测序的转录组学分析发现，TA处理的PRRSV感染细胞中差异表达基因显著富集于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、肿瘤坏死因子（TNF）和白介素-17（IL-17）信号通路。在五个经小干扰RNA（siRNA）介导的功能验证候选基因中，沉默TNFα诱导蛋白3（TNFAIP3，又称A20）最显著地抑制了PRRSV复制。PRRSV感染显著上调TNFAIP3的表达，而TA以剂量依赖的方式逆转了这一上调。TNFAIP3沉默降低了病毒RNA水平、核衣壳（N）蛋白表达和感染性滴度，在感染早期效果最为显著。总之，本研究发现TA是一种强效的抗PRRSV多酚，并揭示了TNFAIP3作为PRRSV感染期间上调的促病毒宿主因子候选者，为理解病毒-宿主相互作用和宿主导向的抗病毒策略提供了潜在靶点。

引言 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种高传染性疾病，其特征是怀孕母猪繁殖障碍和各年龄段猪只的呼吸困难（Benfield等，1992；Rossow，1998）。自20世纪80年代末首次被确认以来，PRRS已蔓延至全球几乎所有主要养猪地区，给养猪业造成了巨大的经济损失（Holtkamp等，2013；Fiers等，2024）。PRRSV是一种有包膜的单股正义RNA病毒，属于小RNA病毒目动脉炎病毒科β动脉炎病毒属（Snijder等，2013；Kuhn等，2016）。其基因组长约15.4 kb，含有至少10个重叠开放阅读框（ORFs），编码病毒复制和免疫调节所必需的结构蛋白和非结构蛋白（Murtaugh等，1995；Dea等，2000；Wootton等，2000；Dokland，2010；Fang和Snijder，2010）。作为RNA病毒，PRRSV具有缺乏3′–5′校对活性的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），导致其突变率较高（Snijder等，2013）。结合其不连续转录机制，频繁的重组事件显著加速了病毒在全球范围内的进化。目前，PRRSV-1和PRRSV-2共同构成的全球流行病学格局十分复杂。例如，北美出现了高毒力L1C 1-4-4变异株（Wiarda等，2026），欧洲出现了Lena（Ruedas-Torres等，2024）和Rosalía（Sánchez-Carvajal等，2026）等高致病性PRRSV-1毒株，凸显了病毒持续进化的态势。在中国，情况同样严峻，以高致病性PRRSV（HP-PRRSV）衍生病毒（Tian等，2007）与NADC30样、NADC34样和QYYZ样等遗传差异较大的谱系共同循环和持续重组为特征，对全球和区域疫病防控构成了严峻挑战（Sun等，2022；Yuan等，2022；Su等，2025；Zhang等，2025, Zhang等，2025；Zhang等，2026）。

目前，疫苗接种仍是PRRS防控的重要策略。然而，现有的商业疫苗，包括减毒活疫苗（MLV，如Lineage 5 PRRS MLV和JXA1-R等多个中国HP-PRRSV弱毒株），对异源毒株仅能提供有限的交叉保护（Liu等，2017, 2024）。此外，MLV疫苗，特别是HP-PRRSV弱毒株，存在毒力回复和与野毒株重组的固有风险，可能产生新的病毒变异体并加剧毒株多样性（Wang等，2022, Wang等，2022；Liu等，2024；Lebret等，2025）。现有疫苗无法实现完全的临床控制，加上缺乏经批准针对PRRSV的抗病毒药物，凸显了对替代治疗方法的迫切需求。因此，兽医和养猪从业者正积极寻求能够缓解临床症状、降低病毒血症、加速群猪稳定并促进病毒清除的新型药物。

天然产物通常来源于传统药用植物或饮食来源，一般具有良好的安全谱。其结构多样性和多靶点药理特性，加上这些有利安全谱，使天然产物成为抗病毒筛选的主要焦点（Adeosun和Loots，2024；Ca?edo-Figueroa等，2025；Prabhu等，2025）。这些努力的目标是鉴定出能够有效减轻病毒复制并改善感染群猪临床转归的强效抗PRRSV候选物。多种天然化合物已显示出通过不同机制抑制PRRSV的活性。例如，大黄素和黄芩素分别通过激活Toll样受体3和免疫相关信号通路来调节宿主反应（Xu等，2021；G. Zhang等，2025）。同时，其他化合物更直接地靶向病毒或其复制过程：原花青素A2与PRRSV颗粒相互作用（Zhang等，2018），表没食子儿茶素没食子酸酯干扰脂质代谢（Ge等，2018），肉桂醛破坏病毒生活史的多个阶段（Song等，2025）。尽管这些研究揭示了在病毒生活史干扰和宿主通路调节水平上的多种抗病毒机制，但功能介导这些化合物抗病毒效应的具体促病毒宿主因子仍有待鉴定。这些发现激发了对新型抗PRRSV候选物的持续搜索，更重要的是，对它们发挥作用的宿主靶点的搜索。

单宁酸（TA）是一种广泛分布于植物组织中的高分子量多酚化合物，传统上用于食品加工和制药应用（Kaczmarek，2020）。TA表现出多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒作用（Fukuchi等，1989；Kaczmarek，2020）。先前的研究报告了TA对多种病毒的抑制活性，包括流感病毒、人类免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒和SARS-CoV-2（Fukuchi等，1989；Chen等，2022；Haddad等，2022），其机制涉及与病毒表面蛋白的直接相互作用和抑制病毒进入（Chen等，2022）。在体内，饮食补充TA螯合锌已被证明可以减轻感染猪流行性腹泻病毒（PEDV）仔猪的肠道损伤和氧化应激（Zhang等，2022），表明基于TA的化合物可能对肠道病毒发挥保护作用。最近，据报道TA衍生的碳点通过多阶段干扰抑制PRRSV和PEDV复制，包括病毒灭活、吸附、侵入和复制，以及下调活性氧（Ren等，2025）。尽管取得了这些进展，天然TA的直接抗PRRSV活性及其潜在的分子机制——特别是其对宿主因子的影响——在很大程度上仍未被探索。

在本研究中，我们系统地评估了TA在MARC-145细胞和原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中的抗PRRSV活性，确定了其有效抑制浓度，评估了其对多个PRRSV毒株的抗PRRSV效力，并确定了其主要作用方式。此外，我们采用基于RNA测序的转录组学分析，表征了PRRSV感染期间TA处理的宿主转录反应。通过差异基因表达分析、通路富集和siRNA介导的功能验证，我们鉴定了宿主因子TNFAIP3（又称A20）作为PRRSV感染期间上调且被TA处理下调的候选促病毒因子（Jeon和Lee，2025；Momtazi等，2019）。这些发现为开发TA作为抗PRRSV候选药物奠定了基础，并突出了TNFAIP3作为宿主导向抗病毒策略的潜在靶点。

方法片段

伦理声明 原代PAM制备方案经中国农业大学实验动物伦理委员会批准（批准号：AW51905202-2-01）。本研究符合当地法律和机构要求。

细胞与病毒 MARC-145细胞（非洲绿猴肾细胞系）用含10%胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific, USA）和1%的Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM；Thermo Fisher Scientific, USA）培养

TA对MARC-145细胞和PAMs的细胞毒性 使用CCK-8法评估了TA在MARC-145细胞和PAMs中的细胞毒性。如图1所示，TA在MARC-145细胞中的CC50为67.23 μM，在PAMs中为179.98 μM，表明PAMs对TA具有更高的耐受性。这些结果为后续抗病毒实验确定了安全浓度范围。

TA在体外抑制PRRSV复制 为评估TA的抗病毒效力，我们使用重组报告病毒RvJX-Nsp2325-HiBiT在基于荧光素酶的测定系统中进行。TA对PRRSV的IC50为

讨论 尽管PRRSV给全球养猪业带来了巨大的经济负担，但目前尚无针对该病原体的抗病毒药物获得临床批准。虽然多种多酚化合物——包括茶多酚（TPP）（Wang等，2021）、(?)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）（Ge等，2018）和原花青素A2（PA2）（Zhang等，2018）——已被证明能在体外抑制PRRSV复制，但其活性的分子基础主要是在水平上进行探索的

CRediT作者贡献声明 Rui Liu：撰写——原稿、可视化、软件、方法学、调查研究、形式化分析、数据整理、概念化。Tianjiao Liu：撰写——原稿、可视化、软件、方法学、调查研究、数据整理、概念化。Chun Miao：监督、方法学、调查研究。Qiongqiong Zhou：资源。Peng Gao：资源。Yongning Zhang：资源。Xinna Ge：资源。Jun Han：资源。Xin Guo：资源。Lei Zhou：撰写——审阅与编辑

伦理声明 本研究遵循以下动物福利和/或报告指南进行：本研究符合当地法律和机构要求。本研究经中国农业大学实验动物伦理委员会批准。（批准号：AW51905202-2-01）

资助 本研究得到国家重点研发计划（2023YFD1800801）、国家自然科学基金（32573333和32330106）、中国农业农村部农业科研体系（CARS-34）和中国农业大学人才发展计划的资助。

利益冲突声明 作者声明没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢 我们感谢农业农村部动物流行病学重点实验室所有工作人员在本研究技术方面给予的指导和帮助。

Rui Liu | Tianjiao Liu | Chun Miao | Qiongqiong Zhou | Peng Gao | Yongning Zhang | Xinna Ge | Jun Han | Xin Guo | Lei Zhou | Hanchun Yang 中国农业大学兽医学院，兽医公共卫生与安全国家重点实验室，北京，100193，中华人民共和国