底栖席状蓝藻浮丝藻（Planktothrix）新株系产结球藻素（Nodularin）的发现：从浮游性微生物席中分离的脱甲基结球藻素[D-Asp1]NOD及其生物合成基因簇解析

《Water Research》：Detection of nodularin in a benthic Planktothrix strain isolated from a tychoplanktonic microbial mat

　　

论文摘要专业翻译 本研究首次报道了从淡水浮游性微生物席（tychoplanktonic microbial mat）中分离的一株底栖非异型胞蓝藻——浮丝藻属（Planktothrix）新株系PLAVEN19ND能够产生结球藻素（nodularin）。该株系分离自意大利东北部一处自然水源，该水源因三头驴死亡事件而受到调查。通过形态测量学与基因组学分析，研究人员将该株系鉴定为浮丝藻属（Planktothrix）成员。该株系仅产生一种脱甲基结球藻素变体[D-Asp1]NOD，在生物量中检测到高浓度（556.90 ± 38.34 μg g?1 干重），同时在培养上清液（spent medium）中亦检出该毒素（97.93 ± 2.95 μg L?1）。全基因组测序（whole-genome sequencing）揭示了一个完整的47-kb结球藻素生物合成基因簇（nodularin biosynthetic gene cluster），该基因簇与产微囊藻素（microcystin）的浮丝藻属菌株的微囊藻素基因簇（microcystin gene cluster）具有98–100%的序列一致性。研究人员进一步讨论了该浮丝藻属分离株中结球藻素基因簇的潜在进化起源。本研究拓展了对底栖非异型胞蓝藻中结球藻素生物合成的认知。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

蓝藻水华已成为全球淡水生态系统日益严峻的环境问题，气候变化进一步加剧了水华的频率与强度，对生态、经济及公共健康构成重大风险。许多蓝藻可产生强效毒性代谢产物（蓝藻毒素，cyanotoxins），对野生及家养动物和人类均构成威胁。长期以来，研究与环境监测主要聚焦于浮游性产毒蓝藻，而底栖蓝藻水华在过去十年间逐渐受到关注。底栖蓝藻定殖于水体底部基质，在沉积物和人工表面形成复杂的微生物席（microbial mats）和生物膜，这些微生物席是产生异味物质、有害蓝藻毒素（如微囊藻素、鱼腥藻毒素-a、柱孢藻毒素）及强效细胞毒素（如tolytoxin）的重要来源。底栖蓝藻毒素产生已在澳大利亚、非洲、欧洲和美洲的19个国家有报道。在适宜条件下，微生物席过度生长并产生气泡，导致席体碎裂并从基质上脱落，富含毒素的脱落席体可漂浮至水面、沿岸线堆积，对动物构成显著风险。

结球藻素（nodularins）是具肝毒性的环状五肽，通过抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2发挥毒性作用，已在全球范围内造成包括狗、牛、羊、马、鱼类和海鸟在内的动物中毒死亡事件。1988至2006年间，已报道六种结球藻素同系物，主要来源于半咸水和盐水环境中的异型胞蓝藻——泡沫节球藻（Nodularia spumigena）。其中结球藻素-R（NOD-R）是水华和培养株系中最常见的变体，而线性、甲基化和脱甲基化变体则为次要成分。尽管结球藻素产生主要归因于N. spumigena及其他异型胞蓝藻，但文献提示这些毒素在自然界中分布更为广泛，尤其是在底栖环境中。

目前微囊藻素和结球藻素的环境检测通常采用高效液相色谱（HPLC）或液相色谱-质谱联用（LC-MS）配合定量标准品、酶联免疫吸附测定（ELISA）或蛋白磷酸酶抑制生物测定等方法。基于微囊藻素合成酶基因簇的发现，发展了不依赖培养的方法以直接在野外检测产微囊藻素蓝藻。早期检测产微囊藻素和结球藻素蓝藻依赖于识别其生物合成基因簇（分别为mcy和nda），多种基于PCR的方法可检测并区分环境样品中的产毒蓝藻。然而，非毒性突变体可导致假阳性，序列变异可导致假阴性，部分Microcystis spp.中不完整的mcy基因簇可能驱动截短四肽代谢物的合成，进一步增加了分子检测结果解读的复杂性。

本研究报道了从意大利东北部一处自然水源中发现的底栖非异型胞淡水蓝藻能够产生结球藻素。该株系分离自一起驴死亡事件后调查的自然水源水华，通过形态测量学和基因组学分析鉴定为浮丝藻属（Planktothrix）成员，产生脱甲基结球藻素变体[D-Asp1]NOD，生物量和培养上清液中均检测到高浓度毒素。全基因组测序揭示了一个完整的47-kb结球藻素生物合成基因簇，与产微囊藻素浮丝藻属菌株的微囊藻素基因簇具有98–100%序列一致性。该研究拓展了对底栖非异型胞蓝藻中结球藻素生物合成的认知。

二、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术手段开展研究：从意大利东北部Pian de le Femene高平原一处浅水洼（海拔1125米，靠近Treviso和Belluno省边界，坐标46°00′48.02″N 12°13′38.14″E）采集漂浮于水面的底栖水华材料，该水洼为半永久性雨水补给池塘，历史上曾用于牲畜饮水。通过平板划线分离和单丝挑取获得纯培养株系PLAVEN19ND，并逐步驯化至Z8培养基获得无菌株系。采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对原始水华材料进行靶向毒素筛查，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF）和高效液相色谱-高分辨串联质谱（HPLC-HRMS/MS）对培养株系进行非靶向代谢物鉴定和定量分析，通过单谱搜索工作流（MASST）在GNPS公共谱库中检索[D-Asp1]NOD。利用PacBio RS II平台进行全基因组测序，采用Flye组装、Prokka和RASTtk注释、antiSMASH预测生物合成基因簇，通过16S rRNA系统发育分析和GTDB-Tk全基因组系统发育分析确定分类地位，采用FastANI进行全基因组平均核苷酸一致性（gANI）分析，并通过滑动窗口分析（DnaSP）比较基因簇序列同源性。

三、研究结果

3.1 形态测量学描述：从水华材料中分离获得无菌蓝藻株系PLAVEN19ND，该株系为底栖丝状蓝藻，具有与颤藻目（Oscillatoriales）一致的形态特征，包括单列直丝状体、无鞘、长度50 μm至3 mm不等，细胞呈圆柱形，平均宽度3.87 ± 0.36 μm、长度2.96 ± 0.58 μm。该株系粘附于培养瓶壁和底部，形成致密凝胶状深蓝绿色席体，丝状体具滑行运动能力，气泡积累导致席体脱落并漂浮至液面。繁殖通过坏死细胞（necridic cells）介导的丝状体断裂实现，顶端细胞圆形，部分具有外壁增厚的顶盖（calyptra）结构。

3.2 结球藻素的检测与定量：原始水华样品经LC-MS/MS靶向分析未检出所测试的微囊藻素同系物、结球藻素-R、鱼腥藻毒素-a和柱孢藻毒素，但观察到两个色谱峰（保留时间1.27分钟和1.82分钟），与任何测试标准品均不对应。分子数据提示微囊藻素或结球藻素产生潜力，mcyE生物合成基因的两个区域扩增阳性。培养株系的UPLC-QTOF非靶向分析在2.42分钟出现主导峰，主要离子为811.4349 m/z，与脱甲基结球藻素的质量谱特征一致。通过碎片模式确认[D-Asp1]NOD的存在，HPLC-HRMS/MS定量显示生物量中浓度为556.90 ± 38.34 μg g?1干重，培养上清液中为97.93 ± 2.95 μg L?1。在指数生长期和所测试的培养条件下，总产量超过180 μg L?1（基于培养干重0.16 g L?1）。GNPS公共谱库检索未发现匹配，表明该分子此前未被记录于已提交的数据文件中。

3.3 基因组特征与分类学定位：获得完整的基因组序列，包括5,559,324 bp环状染色体和单一155,986 bp环状质粒，总大小5.7 Mb，GC含量40.24%。基因组大小介于浮游性株系（4.7–5.4 Mb）和底栖性株系（6–6.7 Mb）之间。16S rRNA系统发育分析确认其属于底栖/双相型浮丝藻属亚簇，与三株P. paucivesiculata菌株（PCC 9631、PCC 8926、PCC 8954）平均99%相似性，与新西兰怀塔基河微生物席来源的Planktothrix sp. PCC 11201（99.9–100%）和CYN61（99.9–100%）高度相似，而与P. serta PCC 8927和P. tepida PCC 9214的相似性低于97%。全基因组系统发育分析确认其位于颤藻目亚支，与Planktothrix sp. PCC 11201聚类于浮游性株系和底栖性株系之间的独立分支。gANI分析显示与新西兰株系PCC 11201共享98%遗传相似性，而与其他欧洲浮丝藻属株系仅84–91%相似，尽管地理上更为接近。

3.4 结球藻素生物合成基因簇：antiSMASH分析鉴定出一个完整的47-kb结球藻素生物合成基因簇，编码七个开放阅读框（ndaA, ndaB, ndaC, ndaD, ndaE, ndaF, ndaI），为杂合非核糖体肽合成酶（NRPS）-聚酮合酶（PKS）酶复合物。核心生物合成酶包括NdaA、NdaB、NdaC、NdaD和NdaF，NdaE和NdaI分别编码O-甲基转移酶和转运蛋白。该基因簇不编码NdaG或NdaH同源物。除NdaA外，所有Nda酶与Planktothrix sp. PCC 11201共享98–100%序列一致性，NdaA与Nodularia spumigena CS-588/02的最近同源物共享77%同源性。基因簇侧翼存在插入序列（insertion sequences），提示与移动遗传元件的关联和潜在的水平基因转移历史。基于结球藻素/微囊藻素合成酶氨基酸序列的系统发育分析显示，PLAVEN19ND的序列更接近其他浮丝藻属的微囊藻素相关序列（95–100%相似性，最高为PCC 11201的99.6%），而非其他属的结球藻素产生菌（平均70–80%），但与法国和土耳其来源的淡水结球藻素产生菌株Nodularia sphaerocarpa PCC 7804和Nodularia spumigena TURKBLM6共享90%相似性。

四、讨论与结论总结

讨论部分：浮丝藻属通常被视为温带地区典型的浮游性水华形成属，但越来越多的证据支持该属内浮游性和底栖性或双相型形态的共存。PLAVEN19ND的形态特征与P. paucivesiculata相似，但由于蓝藻在不同环境和培养条件下形态可塑性高，仅基于培养材料的物种描述可能不可靠，需整合基因组、生态和代谢物谱等多源数据进行多相分类学鉴定。脱甲基结球藻素变体[D-Asp1]NOD此前已在Nodularia属等蓝藻中报道，PLAVEN19ND产生的结球藻素水平与其他蓝藻（特别是底栖属Iningainema，500–1000 μg g?1干重）相当。这是首次报道颤藻目底栖淡水浮丝藻属菌株天然产生[D-Asp1]NOD作为唯一结球藻素变体。基于全基因组ANI阈值（95–96%），PLAVEN19ND与新西兰的Planktothrix sp. PCC 11201很可能属于同一物种，尽管两地气候条件差异显著，提示一种潜在的新型底栖产毒浮丝藻属物种具有更广泛的地理分布。结球藻素基因簇的催化结构域组织与Nodularia spumigena中描述的相同，但基因顺序不同，与产微囊藻素浮丝藻属菌株的微囊藻素基因簇一致。NdaA的双模块结构预测激活N-Me-Thr和D-Asp，与结球藻素生物合成一致。McyF和McyI同源物的缺失可能解释了D-Asp含结球藻素的唯一产生，这与浮丝藻属已知仅掺入D-Asp而非D-Me-Asp的模式一致。研究结果支持nda基因簇通过水平基因转移和重组事件从* mcy基因簇进化而来，包括从编码McyB和McyC的基因中缺失两个模块形成编码NdaA的基因，从而将微囊藻素生物合成簇转化为产生结球藻素的簇。nda和mcy*基因簇在浮丝藻属中的高度遗传相似性对基于PCR的分子检测方法构成挑战，特别是在多种产结球藻素和产微囊藻素菌株共存的复杂底栖或混合微生物群落中，PCR方法可能无法完全区分是否产生一种或两种毒素类别。

结论翻译：本研究报道了从浮游性微生物席中分离的一株底栖淡水浮丝藻属蓝藻能够产生高量脱甲基结球藻素。该株系产生的变体[D-Asp1]NOD在生物量中浓度达556.90 ± 38.34 μg g?1干重，在培养上清液中达97.93 ± 2.95 μg L?1。形态测量学和基因组学分析确认了其分类学位置，而基因组测序揭示了一个完整的47-kb结球藻素生物合成基因簇，与浮丝藻属的微囊藻素基因簇具有98–100%序列一致性。这些发现拓展了产结球藻素蓝藻的隐藏多样性和生态范围，进一步凸显了它们在底栖微生物席中的存在。本研究强调了基因组学进展在揭示产毒蓝藻进化关系和更广泛分布方面的重要性，并进一步强调了监测底栖蓝藻这一新兴且了解甚少的蓝藻毒素来源的必要性。总之，本研究为增进对产生毒素的底栖颤藻目菌株的理解提供了有益的基准，鼓励通过更多采样、分离和多组学表征对更多底栖菌株进行进一步研究。该论文发表于《Water Research》。