移动遗传元件驱动链球菌抗菌药物耐药性传播的机制与防控策略

《Transboundary and Emerging Diseases》：Mobile Genetic Elements Driving the Spread of Antimicrobial Resistance in Streptococci

　　

摘要专业翻译 链球菌是具有适应能力的细菌，可在选择压力下以共生菌或病原菌的形式持续存在。这种适应性受移动遗传元件（mobile genetic elements, MGEs）的影响，MGEs介导水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT），并经常携带抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）和毒力相关基因。本综述概述了参与链球菌（Streptococcus）物种间耐药性获得与传播的MGEs，涵盖人类相关、动物相关及人畜共患链球菌。整合性接合元件（integrative and conjugative elements, ICEs），包括Tn916/Tn1545和Tn5253家族成员及TnGBS相关ICEs，是研究最充分的耐药基因（antimicrobial resistance genes, ARGs）传播载体，因其模块化组织结构支持整合、切除、调控和接合转移。整合性可 mobilizable 元件（integrative mobilizable elements, IMEs）通过利用相容性共驻元件提供的接合机制促进耐药性传播。质粒虽然在若干链球菌物种中不如染色体整合型MGEs显著，但可携带耐药决定簇及复制和 mobilization 功能，参与HGT。插入序列（insertion sequences, ISs）和转座子（transposons, Tns）通过促进基因 mobilization、重组及复杂耐药区域的产生，对基因组可塑性作出贡献。耐药相关元件如Tn917、Tn3872、Tn6002和Tn1207.1相关结构展示了参与大环内酯类和四环素耐药的多种遗传平台。前噬菌体（prophages），包括Φm46.1样元件，促进基因组多样化，并可作为耐药性转移的决定因素。基因组岛和顺式可 mobilizable 元件（cis-mobilizable elements, CIMEs）通过与相容性ICEs相关的重组和 mobilization 扩展 mobilome 多样性。总体而言，这些相互关联的MGEs驱动耐药性的传播、基因组可塑性、生态适应和链球菌的进化多样化。因此，通过改善生物安全、疫苗接种、卫生、营养、饲养管理、疾病预防和及时诊断来减少牲畜抗菌药物使用需求，对于降低选择压力、限制耐药性的持续存在和传播至关重要。这些措施与基因组监测、抗菌药物管理和One Health方法相结合，有助于限制耐药相关MGEs在人类、动物和环境界面间的循环传播。

论文主体内容总结

1. 引言

链球菌属（Streptococcus）包含多种革兰氏阳性病原菌，在人类和动物中引起从浅表黏膜感染到脓毒症、坏死性筋膜炎和脑膜炎等严重侵袭性疾病的广泛临床谱系。临床重要物种包括化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes，A群链球菌）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，B群链球菌）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、C群和G群化脓性链球菌以及咽峡炎链球菌群。抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）危机已被确定为21世纪重大公共卫生挑战，世界卫生组织已将大环内酯耐药GAS、青霉素耐药GBS和大环内酯耐药肺炎链球菌列为细菌优先病原体清单中的中优先级病原体。监测数据显示耐药轨迹令人担忧：肺炎链球菌对青霉素和大环内酯类药物的敏感性广泛降低，克拉霉素和阿奇霉素的全球汇总耐药率分别达57.6%和55.8%；GBS中耐药基因丰度在过去45年间增加了四倍，红霉素表型耐药率高达76.2%，克林霉素58.2%，四环素约89.7%。在分子水平上，链球菌群体中耐药基因的传播主要通过移动遗传元件（mobile genetic elements, MGEs）介导的水平基因转移（horizontal gene transfer, HGT）实现。细菌HGT的三种经典机制为转化、转导和接合。其中，由整合性接合元件（integrative and conjugative elements, ICEs）介导的接合在链球菌中尤为重要，因为这些元件通常携带多个耐药基因和毒力决定簇，促进共选择和多重耐药表型的出现。

2. 链球菌中MGEs的类别与功能机制

2.1 ICEs

ICEs，又称接合型转座子，是研究最充分的染色体整合型MGEs之一，可在多种链球菌物种间传播耐药性。ICEs编码从宿主复制子中切除、通过接合进行细胞间转移以及整合至受体细胞复制子的功能。大多数ICEs编码酪氨酸整合酶，催化元件两侧attL和attR重组位点间相同序列的重组，使环状形式切除并携带attI位点，染色体上则留下attB空位点。转移后，环状ICE主要整合至tRNA或蛋白编码基因的3′端。Tn916是18-kb的ICE，属于大型ICE家族，通过* tet(M)基因赋予宿主四环素耐药性，可转移至革兰氏阳性和阴性细菌。在猪链球菌（S. suis）中描述的主要携带ARGs的ICE家族包括Tn916、Tn5252和Tn1549家族。ICE-emm12编码四环素和大环内酯耐药基因，与香港猩红热化脓性链球菌克隆的出现相关。tet(W)四环素耐药基因已在多个瘤胃细菌基因组的ICEs中被鉴定。最近，噁唑烷酮/苯酚耐药基因optr*A在猪链球菌的ICESa2603家族ICE中被发现。

2.2 IMEs

整合性可 mobilizable 元件（integrative and mobilizable elements, IMEs）编码自身的切除和整合机制，并可劫持或利用相关或无关接合元件的交配装置进行转移。链球菌中的IMEs携带多样的重组模块，具有广泛的整合特异性。几乎所有来自IMEs的丝氨酸整合酶都催化基因内的位点特异性整合，从而破坏这些基因。多数IME丝氨酸整合酶特异性靶向Tn5252超家族的若干保守基因，该超家族是链球菌中广泛分布的ICE群。许多IMEs编码单个位点特异性酪氨酸重组酶，识别IMEs两侧的attR和attL附着位点，通过位点特异性重组催化IME切除。一些对四环素和红霉素耐药的化脓性链球菌菌株携带一个含有两个IMEs的ICE，其中一个携带* tet(O)片段，第二个（IMESp2907）携带红霉素耐药基因erm(TR)。林可酰胺耐药基因在IMEs中也很常见，如携带lnu(P)基因的tISCpe8和携带lnu(C)基因的MTnSag1。其他IME_oriT携带lsa*(C)基因，赋予林可酰胺、链阳菌素A和截短侧耳素耐药性。

2.3 前噬菌体（SMphage家族）

微生物基因组学揭示，在某些细菌中，大量细菌DNA为前噬菌体DNA。前噬菌体可通过携带编码毒素、黏附素和其他毒力相关因子的基因促进细菌致病性。在链球菌中，SMphages携带的ARGs共同赋予多种抗菌药物类别耐药性，包括vanG型万古霉素耐药位点和噁唑烷酮耐药基因optrA。SMphages利用三种类型的整合模块整合至四个染色体附着位点，并在噬菌体诱导时进行切除。噬菌体基因组可含DNA或RNA，DNA可为单链或双链。噬菌体DNA包装过程高度精确，但宿主基因组DNA片段可能以有限频率被包装，产生可附着并将DNA递送至合适细菌的噬菌体颗粒。

2.4 复合转座子（Unit Tns）

Unit Tns传统上被认为是大于插入序列（insertion sequences, ISs）的元件，以反向重复序列（inverted repeats, IRs）为边界，而非一对ISs，包含转座酶基因和可能编码抗生素耐药性的内部"乘客"基因。与链球菌抗生素耐药性最相关的Tn3家族和Tn7样复合转座子包括：携带Tn916 tet(M)基因的元件、携带erm(B)和* tet(O)耐药基因的Tn1545、大环内酯耐药erm(B)的Tn3872、携带 tet(M)的Tn6000、Tn917* erm(A)、Tn5393 catA以及携带aac(3)IV基因的Tn1207.1。

2.5 质粒

质粒是可在合适宿主内自主复制并在细菌分裂时分配至子细胞的染色体外DNA分子。质粒可通过HGT将高频率耐药性和毒力决定簇从一种细菌转移至另一种细菌。然而，在若干链球菌物种中，质粒通常不如染色体整合型MGEs显著，其丰度和贡献在物种和谱系间差异较大。已在无乳链球菌、化脓性链球菌、猪链球菌、副猪链球菌及其他多种链球菌中鉴定出耐药相关质粒。例如，pIP501通过甲基化23S rRNA赋予大环内酯耐药erm(B)并通过外排机制mef(A)发挥作用；pSLA2在肺炎链球菌中提供青霉素耐药bla(Z)并贡献大环内酯耐药erm(B)；pG+：Tn6000在多种链球菌中赋予四环素耐药* tet(M)和大环内酯耐药erm(A)；pRUM在变形链球菌中赋予四环素耐药 tet(M)；pS1在猪链球菌中赋予氨基糖苷耐药aac*(3)-IV。

2.6 转座元件：ISs和复合Tns

转座元件是通过转座酶或重组酶介导机制改变基因组位置的移动DNA序列。在原核生物中，转座元件可分为两大类：ISs和Tns。ISs是最简单的细菌转座元件之一，通常编码两侧为末端IRs的转座酶。复合Tns由两个IS元件侧翼包围额外遗传物质（包括ARGs）形成，允许中间区域作为单一单位 mobilization。在链球菌中已鉴定多种耐药相关转座和复合元件：Tn917携带大环内酯-林可酰胺-链阳菌素B耐药决定簇erm(B)；Tn3872是Tn917插入Tn916样元件形成的复合结构，将erm(B)与四环素耐药基因* tet(M)相关联；Tn6002是另一个携带erm(B)和 tet(M)的Tn916相关元件。Tn916主要携带 tet(M)，而Tn1545携带 tet(M)、erm(B)和aphA-3*，分别赋予四环素类、大环内酯-林可酰胺-链阳菌素B和氨基糖苷类耐药性。其他与耐药基因相关的IS元件包括IS256、IS30、IS1216、IS1485和IS431。

2.7 顺式可 mobilizable 元件（CIME）

顺式可 mobilizable 元件（cis-mobilizable elements, CIMEs）是非自主染色体移动元件，缺乏独立转移所需的完整重组和接合机制，但保留可被相关ICE机制识别的顺式作用序列。当与相容ICE配对时，CIMEs可利用ICE编码的重组和接合功能进行切除、转移和染色体整合。链球菌中的实验研究已证明ICE介导的基因组岛顺式mobilization，确立CIMEs为非自主MGEs的独特类别。在猪链球菌中，已在ICE相关区域鉴定出耐药相关CIMEs，包括CIMESsu14ND71、CIMESsu14ND96和CIMESsu14ND2，这些元件含有AMR决定簇，展示了CIMEs对多重耐药区域组织和传播的贡献。

3. 链球菌中主要MGEs的比较分布与传播网络

3.1 链球菌中MGEs的宿主范围和基因组分布

MGEs在链球菌属中的分布具有异质性，受细菌生态学、基因组相容性、进化历史和抗菌选择压力影响。比较基因组分析显示，ICEs是临床和兽医重要链球菌中分布最广泛的MGEs。Tn916和Tn5252/Tn5253家族成员已在多个物种中被鉴定，表明属内持续的水平转移。相反，前噬菌体分布受限，其多样性和丰度在物种间及密切相关菌株间差异显著。化脓性链球菌拥有属内前噬菌体富集程度最高的基因组之一，而肺炎链球菌和猪链球菌的mobilome含有众多ICEs。质粒不如染色体整合型MGEs普遍，但已在无乳链球菌、猪链球菌及最近的副猪链球菌中持续报道。MGEs的基因组分布高度非随机，ICE整合主要由其同源整合酶的序列特异性决定，这些整合酶识别相容的染色体附着位点（attB），可能位于保守tRNA基因或持家基因座内。

3.2 MGEs对基因组可塑性、适应和进化的贡献

除耐药性传播外，MGEs是链球菌基因组可塑性和适应性进化的主要贡献者。ICEs和IMEs可引入耐药、代谢、细菌素相关及其他辅助功能，而相关元件间的重组可产生具有改变宿主范围或货物基因的新型镶嵌结构。在无乳链球菌中，ICEs和相关元件对基因组多样性贡献显著；在猪链球菌中，染色体接合和可 mobilizable 元件携带多样的耐药和细菌素相关基因，构成辅助基因组的重要组分。链球菌ICEs间的重组也可产生杂合元件，如由猪链球菌ICESsu32457和无乳链球菌ICESa2603衍生的ICE可转移至化脓性链球菌。前噬菌体通过引入辅助基因、促进基因组重排和溶原转换提供额外的进化多样化机制。

3.3 链球菌中MGEs选择和持续存在的生态驱动因素

MGEs在链球菌中的持续存在和传播受人类-动物-环境界面间运作的生态、进化和人为因素影响。抗菌药物暴露是 favoring 耐药相关MGEs维持的重要选择压力。亚抑制浓度抗菌药物可刺激接合并激活SOS反应，促进HGT。宿主相关微生物生态系统进一步促进MGEs的维持和持续存在。口腔黏膜生态位、呼吸道和胃肠道构成高度动态的微生物栖息地，共生链球菌作为遗传储库，通过接合和自然转化促进耐药决定簇与致病性链球菌谱系间的交换。生物膜是MGEs持续存在和传播的特别许可的生态位，胞外聚合基质增强细菌细胞间接触、促进接合转移、促进感受态发育并提供抗抗菌应激保护。许多链球菌MGEs还携带与重金属（铜和锌）、杀生物剂和氧化应激耐药相关的遗传决定簇。集约化畜牧生产系统中，日粮金属补充和广泛消毒剂使用产生持续共选择压力，独立于直接抗菌暴露维持多重耐药MGEs的持续存在和传播。环境储库，包括粪肥、农业土壤、沉积物和地表水，充当MGE多样性的持久储存库，实现基因mobilization、环境持续和重新引入宿主相关微生物群落的循环过程。

4. MGEs研究的实验和计算方法

链球菌MGEs研究日益依赖整合的实验和计算方法。实验上，MGEs活性和转移潜力通常通过PCR检测切除或环状中间体、接合和转化试验以及关键转移基因的突变分析来评估。计算方法方面，全基因组测序，特别是长读长和短读长混合组装，可实现嵌套转座子、ISs和复合岛等复杂元件的精确重建。比较基因组分析已揭示多种链球菌物种中接合和染色体整合型MGEs的广泛多样性和分布。专用工具如ICEscreen、PHASTER、ISEScan和MGEfinder有助于检测ICEs、IMEs、前噬菌体和ISs，但没有单一流程足以完成完整mobilome重建。最可靠的研究将自动预测与人工整理和实验验证相结合，以区分完整移动元件与退化残余，并将基因组数据与生物学功能联系起来。

5. 未来展望与控制策略

5.1 遏制HGT的靶向干预

靶向抑制HGT是限制链球菌耐药相关MGEs传播的关键未来方向。一种有前景的方法是使用基于CRISPR-Cas的抗菌剂选择性消除耐药基因或从细菌群体中清除移动元件。由于许多AMR决定簇位于接合或可 mobilizable 元件上，序列特异性CRISPR策略可在不广泛破坏微生物群的情况下减少这些元件的持续存在。同时，干扰切除、接合或前噬菌体mobilization的干预措施可降低ICEs、IMEs和前噬菌体相关元件的转移效率。此外，减少牲畜抗菌药物使用应被视为限制耐药相关MGEs选择、持续存在和传播的重要补充策略。预防措施包括加强生物安全、疫苗接种、改善卫生、适当饲养密度、优化营养和良好动物饲养实践，可降低传染病发病率，从而减少抗菌治疗需求。早期疾病检测、准确兽医诊断和靶向抗菌治疗可进一步减少不必要或经验性抗菌药物使用。

5.2 One Health框架下的预测性监测

有效的MGEs介导耐药性长期控制还依赖于基于One Health概念建立的预测性监测系统。由于AMR在相互关联的人类、动物和环境界面间出现和循环，监测必须超越临床分离株，扩展至牲畜、野生动物、食品系统、废水和环境储库。基因组监测尤为有价值，可同时追踪细菌谱系、耐药基因和介导其移动的MGEs。此类方法可识别高风险克隆、检测新 mobilizable 的耐药决定簇，并揭示仅基于表型监测无法发现的传播途径。未来监测工作应整合全基因组测序、标准化元数据收集和跨部门数据共享，以支持早期预警系统和更准确的风险预测。

6. 结论与评述

链球菌拥有高度动态的mobilome，对耐药决定簇的获得、维持和传播作出重大贡献。ICEs、IMEs、转座元件、质粒、前噬菌体、基因组岛和CIMEs共同促进链球菌谱系间的HGT，在某些情况下还促进不同细菌物种间的HGT。这些相互关联的MGEs驱动耐药性传播、基因组可塑性、生态适应和进化多样化。通过改善生物安全、疫苗接种、卫生、营养、饲养管理、疾病预防和及时诊断减少牲畜抗菌药物使用需求，对于降低选择压力和限制耐药性持续存在与传播至关重要。这些措施与基因组监测、抗菌药物管理和One Health方法相结合，有助于限制耐药相关MGEs在人类、动物和环境界面间的循环传播。