单斑眼镜蛇（Naja kaouthia）中取毒间隔与毒液变异性关联性的证据

《Toxicon》：Evidence of venom variability associated with venom extraction interval in the monocled cobra ( Naja kaouthia)

　　

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  早期的反复毒液采集显著降低了毒液干重百分比，并改变了主要毒液成分的相对组成。
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  在对照采集后1-7天进行的反复毒液采集显著降低了主要长链α神经毒素的相对丰度。
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  在对照采集后1天进行的反复毒液采集显著增加了磷脂酶A₂和细胞毒素相关成分的相对丰度。
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  单眼镜蛇主要毒液特性恢复到对照水平可能需要至少14天的休息间隔。

引言

蛇毒是一种复杂的生物活性物质，主要由蛋白质和多肽组成，会对身体系统产生各种作用。毒液成分从科间到种内变异存在广泛差异，受多种因素影响，包括季节性变化、饮食、栖息地、年龄相关变化和性别二态性（Chippaux等，1991年）。蛋白质组学研究已表明，主要毒素家族的相对丰度在个体间存在显著差异（Menezes等，2006年；Modahl等，2021年）。毒液成分的这种变异已被广泛认知会导致蛇咬伤患者在临床上表现出不同的症状，并影响抗蛇毒血清的质量，因为毒液是免疫过程中使用的起始材料。目前，许多抗蛇毒血清生产机构从圈养蛇类中获取蛇毒，无论是从其内部设施还是外部供应商获取。每个圈养蛇类集合都有不同的毒液采集方案，每次采集之间的间隔从每2到3周到每3个月不等（世界卫生组织，2017年）。虽然一些研究表明蛇毒补充是一个动态过程，毒液采集后的时间显著影响毒液成分，但获得稳定毒液谱所需的最佳采集间隔的研究仍然匮乏，需要进一步调查。

大多数关于采集间隔对毒液影响的研究是在20世纪70年代使用当时可用的技术进行的。这些研究通常发现，频繁采集毒液会降低平均毒液干重（Ishii，1970年；Kochva，1960年；Marsh和Glaston，1974年），并降低某些酶活性（Schenberg，1970年），但对毒液成分的影响存在争议。对Bitis nasicornis、Trimeresurus flavoviridis和Agkistrodon contortrix piscivorus的研究报道凝胶电泳中毒液成分无差异（Ishii，1970年；Jones，1976年；Marsh和Glatston，1974年），这与Willemse等人（1979年）的研究结果相矛盾，后者发现每日采集导致最初三天凝胶电泳图谱出现差异，4-5天后不再有所不同。后一发现与蝰蛇科毒腺的超微结构研究相一致，这些研究表明采集后分泌细胞出现显著形态学变化，峰值活性出现在采集后4-8天之间（Kochva和Gans，1967年；Ben-Shaul等，1971年；Oron和Bdolah，1978年；De Lucca等，1974年）。此外，Vipera palaestinae、Bitis arietans和Bungarus multicinctus毒腺中的RNA合成活性显示出类似的模式，峰值活性出现在采集后第一周（Rotenberg等，1971年；Currier等，2012年；Yin等，2020年）。尽管这些研究表明采集间隔可能影响毒液成分，但一些毒液成分比较研究并未考虑这一因素，这值得关注。

单眼镜蛇（Naja kaouthia）是一种神经毒性蛇类，广泛分布于泰国各地。N. kaouthia在泰国造成最高的蛇咬伤死亡率，在许多东南亚国家被认为是世卫组织I类医学重要蛇种（世界卫生组织，2017年）。N. kaouthia毒液（NKV）的主要成分是三指毒素家族（3-FTxs）和蛇毒磷脂酶A₂（PLA_2s），其他次要成分包括半胱氨酸富集分泌蛋白、蛇毒金属蛋白酶、L-氨基酸氧化酶等（Tan等，2015年；Xu等，2017年）。NKV引起全身性瘫痪和局部组织损伤，偶尔可导致心脏骤停，需要适当治疗。N. kaouthia抗蛇毒血清在泰国曼谷诗丽吉王后纪念研究所（QSMI）生产，作为单特异性制剂以及神经毒性蛇类多特异性制剂的一部分。QSMI的蛇类养殖场维持超过1000条蛇，以提供持续可靠的毒液供应用于抗蛇毒血清生产和蛇类及蛇毒研究。根据QSMI的《与毒蛇工作的安全手册规程》，毒液采集每4-6周进行一次，以使蛇在后续采集前得到休息。每次毒液采集前两周禁食。毒液混合并冷冻干燥后再转移到进一步抗蛇毒血清生产过程中。尽管QSMI的抗蛇毒血清显示出良好的中和能力（Leong等，2012年；Tan等，2015年），但对当前毒液采集方案对毒液组成影响的研究有助于提高用于抗蛇毒血清生产的毒液质量。

因此，本研究旨在调查不同毒液采集间隔对N. kaouthia毒液特性的影响。以常规禁食时间为两周时的毒液组成作为对照，预期该毒液在捕食和进食过程中被利用。对照点与不同休息间隔的反复采集之间的毒液产量、毒液干重百分比和毒液组成进行了比较。本研究为N. kaouthia各次采集之间适当休息时间提供了科学证据，并阐明了毒液成分比较研究中采集方案的重要性。我们假设不同的采集频率应影响毒液产量和毒液组成，休息时间应超过两周。

章节摘要

实验动物

实验在泰国QSMI的蛇类养殖场进行。所有程序均按照QSMI动物护理和使用委员会批准的指南进行（#04–2025）。

25条圈养N. kaouthia（9条雄性，16条雌性），年龄2–5岁，由QSMI饲养，纳入本研究。蛇被随机分配到五个实验组，每组五条蛇。每条蛇获得的毒液在整个过程中均单独进行处理和分析。

毒液产量和毒液干重百分比

各组对照平均毒液产量为745.20±54.32 mg，组间无显著差异（F_4,20 = 0.641，P = 0.639）。各不同时间间隔的反复采集也未发现采集间隔的显著主效应（F_(4,20) = 0.670，P = 0.621）或采集状态的显著主效应（F_(1,20) = 3.413，P = 0.080）。采集间隔与采集状态之间的交互作用也不显著（F_(4,20) = 1.914，P = 0.148），表明差异

讨论

本研究的结果显示了毒液采集间隔对N. kaouthia毒液产量和毒液组成的影响，证实了研究的假设。尽管新鲜毒液产量在各组间无差异，但早期反复采集显著降低了%干重，随后逐渐增加，至14天间隔时与对照无差异。早期反复采集影响了NKV的主要成分。富含长链α神经毒素的3-FTx

结论

本研究展示了N. kaouthia毒液补充的动态过程，证实了毒液采集间隔显著影响毒液特性的假设，应在毒液生产和毒液组成比较研究中予以考虑。虽然新鲜毒液产量在所有组中保持相对恒定，但早期反复采集（1–10天内）导致毒液干重百分比显著降低，并造成毒液的显著改变

CRediT作者贡献声明

Taksa Vasaruchapong：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿撰写，可视化，验证，软件，资源，项目管理，方法学，调查，形式分析，数据整理，概念化。Tanapong Tawan：项目管理，调查，数据整理。Wichit Thaveekarn：写作 – 审阅与编辑，软件，调查，数据整理。Choo Hock Tan：写作 – 审阅与编辑，软件，调查，数据整理。Panithi Laoungbua：软件，

未引用参考文献

Ben-Shual等，1971年；Gopalakrishnakone等，2017年；Ishii等，1970年；Luna等，2013年；Mohamed Abd El-Aziz等，2019年；Oron等，1978年；Soopairin等，2023年；世界卫生组织，2017年。

伦理声明

动物护理和实验方案已获得诗丽吉王后纪念研究所动物护理和使用伦理委员会批准（批准编号QSMI-ACUC-04-2025），并符合泰国国家研究委员会的指南。

利益冲突声明

作者声明他们不存在任何已知的可能影响本文报道工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

我们要感谢QSMI蛇类养殖场的所有蛇类处理人员，感谢他们对N. kaouthia的良好照料。

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