《Translational Oncology》：Integrative single-cell and computational pathology analyses reveal a C11orf24-associated stem-like epithelial population linked to tumor microenvironment remodeling and immune evasion in bladder cancer
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膀胱癌（bladder cancer，BLCA）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，亦是全球范围内癌症相关发病和死亡的主要原因。尽管外科治疗、全身化疗和免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）取得了进展，但由于频繁复发、转移性
膀胱癌（bladder cancer，BLCA）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，亦是全球范围内癌症相关发病和死亡的主要原因。尽管外科治疗、全身化疗和免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）取得了进展，但由于频繁复发、转移性播散和治疗耐药，晚期患者的临床结局仍不理想。肿瘤内及肿瘤间存在显著异质性，导致即使临床病理特征相似的患者其临床行为和治疗反应也截然不同。因此，阐明这种异质性的细胞和分子基础对于制定更有效的BLCA精准肿瘤学策略至关重要。越来越多的证据表明，癌症干样细胞（cancer stem-like cells，CSCs）在肿瘤发生、进展、转移和治疗耐药中发挥核心作用。通过自我更新、表型可塑性和多谱系分化能力，CSCs被认为可维持肿瘤演变并导致治疗后的疾病复发。在BLCA中，干性相关的转录程序与侵袭性临床病理特征和不良预后相关。然而，恶性上皮干性背后的细胞层级结构仍未得到充分表征。特别是，BLCA中是否存在不同的干样上皮细胞群体、这些群体与肿瘤分化轨迹的关系，以及它们如何与周围肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）相互作用以影响疾病进展，目前仍不清楚。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）的最新进展为在细胞分辨率下解析肿瘤生态系统提供了前所未有的机会。单细胞研究揭示了恶性上皮细胞中广泛的异质性，并鉴定了共同塑造肿瘤行为的多种免疫和基质细胞群体。然而，以往大多数研究主要集中于编目细胞多样性，而恶性上皮亚群之间的发育关系以及将上皮干性与微环境重塑联系起来的生物学机制仍然知之甚少。此外，尽管空间转录组学已能够研究完整组织内的细胞组织，但BLCA中干样上皮细胞的空间结构和生态相互作用在很大程度上仍未被探索。与此同时，计算病理学和人工智能已成为从常规组织病理学图像中提取临床相关信息的强大工具。越来越多的证据表明，组织形态学模式可以捕获潜在的分子状态并预测患者结局。然而，大多数基于图像的预后模型在很大程度上仍是数据驱动的，缺乏机制性的生物学解释。弥合单细胞衍生的生物学见解与临床可获取的病理特征之间的差距，可能为将分子发现转化为实用的预后和治疗应用提供有吸引力的策略。在此，通过单细胞转录组学、空间转录组学、计算病理学和功能实验的整合分析，研究人员鉴定了BLCA中一个先前未被识别的、占据恶性上皮分化层级顶端的高度干样上皮细胞群（HStem）。研究发现HStem细胞在肿瘤生态系统中表现出高推断通信活性，并优先与成纤维细胞和内皮细胞相互作用，而HStem相关状态与免疫排斥和预测的免疫治疗耐药相关。利用HStem相关的转录程序，研究人员进一步开发并验证了一种基于图像的预后模型，该模型能够从常规组织病理学图像中进行稳健的风险分层。最后，研究人员鉴定了C11orf24作为与HStem表型相关的候选调控因子，并通过实验证明了其对BLCA细胞恶性表型的影响。总之，这些发现建立了一个连接膀胱癌上皮干性、微环境重塑、病理影像特征和临床结局的综合框架。
**论文解读：整合单细胞与计算病理学揭示BCLA中C11orf24相关干样上皮细胞群促进微环境重塑与免疫逃逸**
**一、研究背景与科学问题**
膀胱癌（bladder cancer，BLCA）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，尽管手术、化疗及免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）等治疗手段不断进步，晚期患者因频繁复发、转移和治疗耐药，预后仍不理想。肿瘤异质性是导致治疗失败的核心原因之一，而癌症干样细胞（cancer stem-like cells，CSCs）被认为通过自我更新、表型可塑性和多谱系分化能力驱动肿瘤演进、治疗耐药与复发。然而，BLCA中恶性上皮干细胞样状态的细胞层级结构尚不清楚：是否存在独特的干样上皮亚群？其分化轨迹如何？它们如何与肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）相互作用？以往单细胞研究多聚焦于细胞多样性编目，缺乏对恶性上皮亚群发育关系及其与微环境重塑机制的深入解析。同时，空间转录组学虽可研究组织原位结构，但干样上皮细胞在BLCA中的空间生态尚属空白。此外，计算病理学模型大多纯数据驱动，缺乏生物学机制解释。因此，如何桥接单细胞生物学发现与临床可及的病理图像，构建机制可解释的预后工具，是亟待解决的关键问题。
**二、研究内容与结论**
研究人员通过对13例未治疗BLCA样本的92,218个细胞进行整合单细胞转录组分析，并结合空间转录组学、计算病理学、药效基因组学预测及体外功能实验，系统解析了BLCA恶性上皮的干性图谱。研究发现了一个位于恶性上皮分化层级顶端的高度干样上皮细胞群（highly stem-like epithelial population，HStem），其具有高干性评分、活化MYC/氧化磷酸化/糖酵解等代谢程序，并通过MIF-CD74/CXCR4及MIF-CD74/CD44配体-受体轴优先与成纤维细胞和内皮细胞通信，形成干性支持生态位。基于HStem特征基因与病理图像特征，研究人员开发并验证了StepCox(forward)+Ridge机器学习预后模型，可有效进行风险分层。高风险肿瘤呈现免疫排斥和免疫抑制特征，预测对ICB反应不佳。进一步鉴定了与HStem表型强相关的枢纽基因C11orf24，体外实验证实其促进BLCA细胞增殖、迁移、侵袭并上调干性标志物SOX2、ALDH1A1和CD44表达。该研究建立了从上皮干性、微环境重塑、病理影像到临床结局的整合框架，为BLCA精准治疗提供了新靶点和预后工具。
**三、主要关键技术方法**
本研究使用了以下核心技术方法：1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析，采用Seurat（v4.3.0）流程、Harmony算法整合去批次、UMAP降维聚类，数据来源于GEO公开数据集GSE222315（13例BLCA样本）；2）干性评估采用CytoTRACE（v0.3.3）计算分化潜能，按四分位数将恶性上皮分为HStem、DTStem和LStem三群；3）发育轨迹重建采用Monocle2（v2.26.0）；4）细胞间通信分析采用CellChat（v2.2.0）推断配体-受体互作；5）基因调控网络采用pySCENIC（v0.12.1）；6）共表达模块鉴定采用hdWGCNA；7）空间转录组数据（GSE246011、GSE238145、GSE285715）采用Seurat+SCTransform整合、RCTD反卷积和MISTy空间互作分析；8）病理图像预后模型构建结合CellProfiler定量形态学特征与ResNet50深度学习特征，经101种算法组合交叉验证筛选最优模型；9）药物敏感性预测使用GDSC、CTRP、PRISM和BeyondCell数据库；10）体外功能实验采用慢病毒介导的C11orf24过表达和敲低，进行克隆形成、划痕愈合和Transwell迁移侵袭实验。
**四、研究结果**
**1. 单细胞转录组图谱揭示BLCA上皮异质性**：对GSE222315数据集中92,218个细胞进行无监督聚类，鉴定出B细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞、髓系细胞、浆细胞、增殖细胞和T/NK细胞九大谱系。上皮细胞表现出显著的瘤间和瘤内异质性，且NAT与肿瘤标本聚类模式明显不同，细胞组成随淋巴血管浸润、肿瘤大小、病理分级和临床分期而变化。ssGSEA显示上皮细胞富集增殖和代谢程序，免疫细胞富集免疫相关特征。
**2. 鉴定具有独特拷贝数和发育轨迹的高度干样上皮亚群**：InferCNV分析证实上皮细胞存在广泛拷贝数变异，肿瘤与正常来源明显分离。CytoTRACE评分呈现连续分化谱，按四分位数将恶性上皮分为HStem、DTStem和LStem三群。Monocle2伪时间轨迹重建了从HStem经DTStem到LStem的分化层级，并显示分化相关基因沿轨迹动态变化。HStem细胞富集于晚期肿瘤（T1N1M0），LStem细胞多见于早期病变（T1N0M0）。GSEA和scMetabolism分析显示HStem细胞激活MYC靶点、氧化磷酸化、DNA修复和糖酵解通路，以及谷胱甘肽代谢和活性氧信号增强。
**3. HStem细胞与肿瘤微环境建立特化细胞间通信**：CellChat分析显示HStem细胞在BLCA微环境中表现出最高的推断通信活性和互作强度，与成纤维细胞、内皮细胞和增殖细胞优先互作。MIF-CD74/CXCR4和MIF-CD74/CD44是突出预测的配体-受体轴。空间转录组分析在多个样本中验证了HStem相关肿瘤区域与成纤维细胞和内皮细胞的空间共定位，为肿瘤-基质关联提供了正交空间证据。
**4. hdWGCNA鉴定富集于HStem细胞的干性相关基因共表达模块**：对恶性上皮细胞应用hdWGCNA鉴定出六个共表达模块（M1–M6）。M5和M6模块选择性富集于HStem细胞。HStem与LStem差异表达分析鉴定出1032个差异基因，其中86个上调的HStem富集基因与M5和M6枢纽基因显著重叠，构成86基因HStem特征签名。疾病本体论富集分析显示该签名与膀胱癌、移行细胞癌和肾细胞癌等癌种显著相关。
**5. 开发并验证基于HStem的影像预后模型**：结合全切片图像（whole-slide image，WSI）斑块提取、CellProfiler病理特征量化、ResNet-50深度学习特征提取和相关性特征选择，对101种算法组合进行基准测试，确定StepCox(forward)+Ridge为最优模型。训练队列（298例，139例死亡）和验证队列（76例，31例死亡）中，高风险患者总生存期显著较差。限制性立方样条分析显示风险评分与风险比呈非线性单调递增关系。多因素Cox回归证实风险评分是独立预后因素（HR=1.68，95%CI：1.08–2.60，P=0.022）。校准曲线和决策曲线分析支持模型预测准确性和临床实用性。
**6. HStem衍生风险评分与免疫排斥和预测免疫治疗耐药相关**：高风险肿瘤中CD8+ T细胞、NK细胞和活化树突状细胞等细胞毒性免疫群体浸润显著减少，而调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）等免疫调节群体丰度增加。免疫排斥特征（成纤维细胞相关程序和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）签名）在高风险肿瘤中富集。TIDE分析显示高风险患者预测免疫逃逸潜能增强、ICB反应受损。组织病理学检查显示高风险肿瘤缺乏或仅有稀疏淋巴细胞浸润，而低风险肿瘤呈现显著富淋巴细胞的间质反应。GDSC药物敏感性预测显示高风险患者对达沙替尼、AZD8055和luminespib预测敏感性增强。
**7. C11orf24作为HStem相关枢纽基因具有致癌功能**：六个HStem枢纽基因（C11orf24、CANX、VEGFB、ARF6、ALYREF和EIF3A）中，C11orf24与HStem风险评分正相关性最强，并与多个预后病理图像特征显著关联。TCGA-BLCA队列中多数枢纽基因在肿瘤组织中较正常组织显著上调，配对样本分析验证了这一发现。Kaplan-Meier生存分析显示C11orf24高表达在TCGA-BLCA和GSE31684队列中均与不良预后一致相关。C11orf24表达与多种免疫浸润特征和癌症干细胞功能状态（包括EMT、侵袭、转移、增殖和干性）正相关。
**8. C11orf24定义具有增强干性和侵袭性信号传导的恶性上皮亚群**：将恶性上皮分为C11orf24阳性（C11orf24+ Epi）和阴性（C11orf24? Epi）亚群后，GSEA显示C11orf24+ Epi细胞富集MYC靶点、氧化磷酸化、DNA修复、化学致癌、糖酵解和谷胱甘肽代谢通路。CytoTRACE分析确认C11orf24+ Epi细胞具有更高干性评分，C11orf24表达与干性潜能显著正相关。Slingshot轨迹推断将C11orf24+ Epi细胞置于发育层级根部，沿伪时间C11orf24表达逐渐丢失。PySCENIC分析显示C11orf24+ Epi细胞激活FOXA1、JUND和FOS转录因子调控网络，而C11orf24?Epi细胞以SOX4和SPI1活性为特征。CellChat分析显示C11orf24+ Epi细胞优先与成纤维细胞、内皮细胞和髓系细胞通信。MistyR空间分析证实C11orf24+ Epi细胞与成纤维细胞和内皮细胞在瘤内生态位共定位。
**9. 实验验证支持C11orf24在膀胱癌细胞中的致癌作用**：在EJ和T24 BLCA细胞系中进行功能获得和缺失研究。RT-qPCR确认C11orf24过表达和敲低的效率。克隆形成实验表明C11orf24过表达显著增强克隆形成能力，敲低则显著抑制。伤口愈合实验显示过表达加速迁移，敲低损害迁移。Transwell实验证实过表达增加迁移和侵袭细胞数，敲低则抑制。这些发现表明C11orf24在体外功能上促进BLCA细胞的增殖、迁移和侵袭。在EJ细胞中，C11orf24过表达增加SOX2、ALDH1A1和CD44的mRNA和蛋白水平；在T24细胞中，敲低则降低这些干性标志物水平。在C11orf24沉默的T24细胞中重新表达C11orf24可部分恢复这些干性标志物的表达，为C11orf24与BLCA细胞干性表型的关联提供了实验支持。
**10. C11orf24阳性上皮细胞表现出预测的治疗脆弱性**：利用BeyondCell框架进行单细胞药物敏感性筛选，鉴定出CEPHAELINE和SPIRONOLACTONE为C11orf24+Epi细胞中预测优先敏感的候选化合物。C11orf24+Epi细胞对两种化合物的药物敏感性评分显著高于C11orf24?Epi细胞。UMAP特征图将药物反应签名定位于HStem富集区域，小提琴图确认HStem相对LStem群体的预测敏感性更高。这些药效基因组学预测属于假设生成性质，需在临床前模型中实验验证。
**五、讨论与结论**
本讨论部分首先强调了肿瘤异质性对有效治疗的障碍。尽管既往单细胞研究已揭示BLCA的细胞多样性，但恶性上皮亚群间的发育关系及其对疾病进展的贡献仍不明确。本研究通过整合InferCNV、CytoTRACE和伪时间分析，识别了从HStem细胞经中间态向终末分化上皮细胞延伸的连续分化轨迹，并发现HStem细胞优先积累于晚期肿瘤且激活MYC信号、氧化磷酸化、DNA修复、糖酵解和谷胱甘肽代谢，支持干样上皮细胞作为肿瘤进展和表型多样化储库的层级模型。其次，HStem细胞作为肿瘤生态系统中的主要通信枢纽，通过MIF-CD74/CXCR4和MIF-CD74/CD44信号轴与成纤维细胞和内皮细胞强互作，与干性支持生态位的存在一致。第三，该研究将单细胞生物学见解与计算病理学整合，开发的图像预后模型在独立队列中表现稳健，可作为独立预后因素，凸显了计算病理学弥合分子发现与常规临床实践的潜力。第四，高风险肿瘤呈现免疫排斥和免疫抑制微环境，TIDE分析提示免疫逃逸增加和ICB反应降低，表明干性可能是连接肿瘤内在可塑性和免疫逃逸的中心生物学过程。第五，C11orf24作为枢纽基因，其扰动改变SOX2、ALDH1A1和CD44表达，支持其与干性相关分子特征的关联；功能实验证实其促进增殖、迁移、侵袭和克隆形成，提示其作为预后生物标志物和候选治疗靶点的潜力。
研究结论：该研究鉴定了与BLCA肿瘤进展和免疫重塑相关的高度干样上皮细胞群。通过整合单细胞和空间转录组学与计算病理学，建立了连接上皮干性、微环境互作和患者结局的临床相关框架。此外，研究鉴定了C11orf24作为干样状态的候选调控因子和潜在治疗靶点。这些发现推进了对BLCA生物学的理解，并为干性导向的精准肿瘤学提供了新机会。
研究局限性包括：HStem介导的细胞间通信推断主要基于计算分析，需体内验证；单细胞分析基于单一队列GSE222315，尚需独立单细胞复制队列确认HStem/DTStem/LStem分类的稳健性；功能实验主要在EJ和T24细胞系中进行，需更多分子亚型和分化状态的BLCA模型验证泛化性；C11orf24调控干性和微环境互作的生物学机制尚未完全阐明，功能回复实验和体内验证仍属必要；影像预后模型需前瞻性多中心验证；干性分类主要基于CytoTRACE，未使用CytoTRACE2或StemID等正交干性指标；药效基因组学预测化合物仍需临床前模型实验验证。
