基于 DNA 三角棱柱的分子内催化发夹组装用于活细胞中凋亡相关 mRNA 的灵敏成像

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Intramolecular catalytic hairpin assembly on a DNA triangular prism for sensitive imaging of apoptosis-related mRNA in living cells

　　

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  一种通过避免复杂序列设计来实现高负载量和低成本的设计策略。
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  从机制上证明了空间限域效应和邻近效应如何加速反应动力学。
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  卓越的检测性能，包括高灵敏度、高选择性、良好的生物相容性和稳定性。
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  成功实现了活细胞内与凋亡相关的mRNA动态成像，突显了该探针在癌症诊断和凋亡机制研究中的潜在应用价值。

引言

细胞凋亡是一种由基因编程控制的细胞死亡方式，对于正常的发育、组织重塑以及衰老、感染或转化细胞的消除至关重要，其失调与多种人类疾病密切相关，包括癌症和自身免疫性疾病 [1]、[2]。细胞凋亡失调与各种疾病紧密相关，尤其是癌症，其中异常的细胞存活信号会导致肿瘤进展和治疗耐药 [3]。因此，实时监测细胞凋亡过程中的关键分子事件对于理解疾病机制和评估治疗效果至关重要。信使RNA（mRNA）是一种携带遗传信息到核糖体的RNA类型，在那里可被翻译成功能性蛋白质。据报道，当细胞响应外部刺激或内部基因程序时，会调节特定mRNA的亚细胞分布和表达 [4]。同时，细胞中mRNA的差异表达水平与某些疾病相关 [5]。MnSOD mRNA是线粒体凋亡通路的上游调控因子；其抑制会升高ROS并触发细胞色素c（Cyt c）的释放 [6]、[7]。MnSOD mRNA也具有应激响应性，因此其在凋亡过程中的变化具有上下文依赖性 [8]、[9]。在癌细胞中，MnSOD mRNA的过表达可保护细胞免受ROS诱导的损伤，而其下调则促进凋亡 [6]。此外，MnSOD mRNA的表达具有癌症类型依赖性 [10]、[11]，表明其调控作用并非单向性的。这些特征使MnSOD mRNA成为研究凋亡相关信号通路的一个具有生物学意义的靶标。

在mRNA检测方法中，Northern Blot是一项成熟的传统技术，而定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）[12] 是一种具有高灵敏度的常规扩增方法。尽管这些方法在缓冲液、细胞裂解液或血清样品中表现有效，但它们受限于复杂的操作流程和缺乏实时检测能力，限制了其在实时mRNA监测和不同细胞类型间mRNA表达准确定量方面的适用性。然而，活细胞荧光成像具有若干独特的优势。首先，它能够在单细胞水平获取时空信息，实现对分子事件在其天然细胞环境中的实时可视化。其次，它无需复杂的提取和纯化步骤，从而保持细胞微环境的完整性并避免处理过程中产生的伪影。第三，它支持对活细胞中动态分子过程（如mRNA表达变化）进行长期的无创纵向监测。重要的是，荧光成像能够在明显的形态学变化出现之前检测到分子变化，为病理评估和及时治疗干预提供了早期窗口。这些能力使荧光成像成为研究动态信号通路不可或缺的工具，并在癌症早期诊断和预后评估方面具有广阔的前景 [13]、[14]、[15]。因此，许多基于荧光成像技术的方法已被构建用于生物成像 [16]、[17]。其中，基于DNA纳米技术的方法因其优异的编程性、高生物相容性、强靶标识别特异性和结构可调性而受到研究人员的越来越多的关注。因此，DNA纳米技术已被广泛用于构建各种用于活细胞中mRNA成像的纳米探针 [18]、[19]、[20]、[21]、[22]。最近，一些基于动态DNA自组装的无酶扩增方法，如催化性发夹组装（CHA）[23]、杂交链式反应（HCR）[24]和熵驱动电路（EDC）[25]、[26]、[27]，已被开发用于活细胞中靶标的分析。

尽管取得了这些进展，但在实现活细胞内实时成像方面仍存在若干挑战。首先，mRNA表达的丰度较低，要求探针具有高灵敏度 [28]。其次，游离DNA探针（即分散在溶液中、未被固定的发夹）缺乏固有的细胞穿透能力，因此依赖于转染试剂或纳米载体进行细胞递送 [29]、[30]。第三，复杂的生物环境——特别是核酸酶和血清成分的存在——可迅速降解游离探针及其反应产物，损害信号稳定性 [31]、[32]。这些局限性凸显了对一种纳米载体的需求，它不仅能够递送和保护探针，还能以空间有序的方式实现高负载量的功能性发夹，从而在降低成本的同时提高反应效率。

为满足这些需求，DNA纳米结构上的空间限域分子内CHA已成为一种有前景的策略。例如，Qing等人 [33] 证明将两个发夹探针锚定在DNA四面体上，通过空间限域效应显著提高了反应动力学和信号稳定性。然而，四面体有限的顶点数量限制了探针负载量，且缺乏多个发夹对的精确空间组织，这可能进一步限制了扩增效率。相比之下，DNA三棱柱（DTP）具有独特的优势：拥有六个顶点和刚性的三维架构，它提供了更广泛且易于修饰的杂交位点，从而实现更高的负载量和功能性探针更灵活的空间排布。

在此，我们在DNA三棱柱（DTP）上构建了一种高负载量的分子内催化性发夹组装（intra-CHA3探针），用于活细胞中MnSOD mRNA的灵敏检测和成像。DTP提供了具有六个易于修饰的杂交位点的刚性三维纳米结构，通过简单的DNA连接链将三个H₁发夹精确排列在一个面上，将三个H₂发夹排列在对面，从而避免了复杂的序列设计。这种面选择性锚定不仅最大限度地提高了负载量，还引入了一种额外的邻近效应：在MnSOD mRNA存在的情况下，与H₁的杂合恢复了猝灭的Cy3荧光，并触发了循环扩增过程，因为释放的mRNA迅速与同一DTP上相邻的H₁杂合。得益于空间限域效应和邻近效应，intra-CHA3探针的反应效率显著加速，从而实现了增强的靶标循环利用。此外，DTP支架赋予了更好的核酸酶抗性、结构稳定性和细胞内化能力。因此，该策略提供了一个稳健且灵敏的活细胞mRNA成像平台，解决了现有基于CHA的系统的关键局限性，同时实现了高负载量、简化的序列设计和低成本。

各章节摘要

材料和试剂

DNA序列（表S1）购自上海 Sangon Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）和苏州 GENEWIZ BIOTECH（中国苏州）。staurosporine（STS）购自上海 Macklin Biochemical Co., Ltd.。牛血清白蛋白（BSA）购自晶瑞。谷胱甘肽（GSH）、l-赖氨酸（L-Lys）、钙离子（Ca²⁺）和 d-葡萄糖（D-Glc）购自阿拉丁。L-丙氨酸（L-Ala）购自天津光复。抗坏血酸（AA）购自 Sigma-Aldrich。FBS（Gibco）购自

intra-CHA3探针的原理

如图1所示，DTP由三条序列（S1、S2、S3）通过一锅退火法构建（步骤1）[34]、[35]。DTP的三条垂直边形成双链结构，赋予其刚性的三维（3D）架构。其余位于底面和顶面的六条边提供了六个不同的杂交位点用于装载功能组分。相应地，设计了六条简单的DNA连接链与

结论

综上所述，我们开发了一种基于DNA三棱柱（DTP）的高负载量分子内催化性发夹组装（intra-CHA3探针），用于活细胞中MnSOD mRNA的灵敏检测和实时成像。通过合理设计六条简单的DNA连接链，将三对发夹结构（H₁和H₂）以面选择性的方式精确锚定在DTP上，实现了高负载量的同时避免了复杂的序列设计并降低了成本。所构建的intra-CHA3探针

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究由国家自然科学基金（NSFC，编号：22504155和22074124）、中央高校基本科研业务费专项资金（编号：XDJK2020TY001和SWU-KR26007）、四川省中枢神经系统产品研发重点实验室、四川信立医药CO., Ltd.（编号：260002-01SZ）、重庆市研究生科研创新项目（编号：CYS260179）资助。自然科学基金

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