等离子体活化水（PAW）洗涤后人羊膜（AM）组织学结构与傅里叶变换红外光谱（FTIR）多变量表征

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Spectroscopic and structural characterization of human amniotic membrane after washing with plasma-activated water

　　

摘要译文：人羊膜（AM）经等离子体活化水（PAW）洗涤后的光谱学与结构表征。
• PAW洗涤对人羊膜（AM）的影响。
• PAW洗涤后组织学结构未见变化。
• 傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示组间无差异。
• 层次聚类分析（HCA）显示组间无显著变化。
• 主成分分析（PCA）显示差异不在处理组之间，而在膜侧。

该研究围绕人羊膜（amniotic membrane, AM；来源于人胎盘、富含胶原及生物活性分子的生物材料）在组织修复与再生医学中的应用展开。尽管组织工程和细胞培养技术已有显著进展，复制天然组织细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的复杂结构及生物活性成分仍具挑战，因此保留结构和生物特征的生物移植物仍广泛用于临床。AM具有促愈合、抑菌、促进上皮细胞生长与分化、低免疫原性等特性，应用涉及眼科、烧伤、牙科和再生医学，其性能与高浓度胶原及参与细胞调控、免疫调节和组织修复的分子相关。AM加工中需消毒和保存而不破坏结构；伽马辐射虽常用，但可导致胶原和生物分子降解，抗生素和抗真菌药则存在污染菌耐药等问题。PAW（plasma-activated water, PAW；经等离子体放电功能化、含活性氧氮物种的水）廉价且具强抗菌活性，但其是否能在保持AM结构和生化特征的同时用于洗涤尚不明确。因此，研究人员比较抗生素处理（antibiotic treatment, ATB）与PAW洗涤后AM的组织学结构和FTIR光谱特征，并结合HCA和PCA评估处理相关差异。研究结论显示，PAW洗涤未改变AM组织学架构，未检测到主要组织学和生化改变；光谱变异主要来自AM上皮层与间充质层的固有差异而非处理。该研究为PAW作为非抗生素替代用于AM处理提供了结构学证据。

关键技术方法：样本来源为3例剖宫产胎盘。研究人员以滑动弧等离子体系统（18.4 W、60 Hz；氩气6 L/min与压缩空气4 L/min混合）处理反渗透水30 min制备PAW，并将每例AM分为ATB组与PAW组洗涤30 min后冷冻保存。采用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色进行组织学观察；采用衰减全反射（attenuated total reflectance, ATR）FTIR在4000–500 cm^?1、分辨率4 cm^?1采集光谱，并行基线校正、归一化、Savitzky–Golay平滑与二阶导数处理；以HCA（1400–1700 cm^?1）和PCA分析光谱；统计采用配对Student t检验及两因素重复测量方差分析（analysis of variance, ANOVA）。

研究结果如下。

3.1 组织学（Histology）：通过H&E染色观察AM-ATB与AM-PAW组，两组组织学切片未见差异；均显示完整上皮层，呈均匀连续的立方细胞层、胞质非空泡化，细胞与基底层保持连接，基质区维持致密胶原层且无差异。结论为PAW洗涤后未观察到组织学结构改变。

3.2 FTIR光谱分析（FTIR spectra analysis）：通过定性分析ATB与PAW组上皮层和间充质层光谱，两层均可见Amide A（约3300 cm^?1）、Amide B（约3080 cm^?1）、Amide I（约1631 cm^?1）、Amide II（约1548 cm^?1）及Amide III（上皮层约1035–1453 cm^?1，间充质层约1077–1453 cm^?1）。上皮层Amide I和Amide II区强度未见变化；PAW组Amide III区1159 cm^?1峰强度降低，该峰与糖原相关振动、核酸、核糖及CO-O-C反对称伸缩相关，同时1035 cm^?1峰强度升高，该峰与碳水化合物相关振动、糖原、脱氧核糖及CO伸缩振动相关，此改变可能归因于冷冻保存所用甘油。间充质层PAW组亦见Amide III区变化，表现为1156 cm^?1峰强度降低及1743 cm^?1峰强度降低，后者代表甘油三酯和胆固醇酯的CO伸缩振动。通过峰强度与Amide I峰强度比值进行定量分析，上皮层1035 cm^?1和间充质层1743 cm^?1的变化具有统计学意义（p < 0.05），而上皮层1159 cm^?1和间充质层1156 cm^?1的变化不显著。结论为处理组在主要蛋白相关谱带相似，指纹区存在有限峰变化。

3.3 HCA分析（HCA analysis）：通过对1400–1700 cm^?1光谱区（代表Amide I和Amide II峰）进行HCA，ATB与PAW处理样本在上皮层和间充质层均未形成明显分离聚类；光谱重叠，最大连接距离仅0.035，提示光谱高度相似。结论为PAW处理未在AM蛋白相关分子结构中产生可检测改变。

3.4 PCA分析（PCA analysis）：通过对完整FTIR光谱范围进行PCA，前四个主成分的得分散点矩阵显示光谱最一致的组织方式与膜层相关，尤其沿第一主成分（PC1）；PAW与ATB处理样本在得分空间广泛重叠，未形成独立簇。PC1解释总光谱变异的78.80%，第二主成分（PC2）解释12.62%，累计91.42%；PC1–PC2得分图中，间充质层光谱主要分布于PC1负值侧，上皮层光谱主要分布于PC1正值侧，处理组在两层区域内交错。载荷分析显示PC1最高绝对载荷约在1627 cm^?1（+0.07297），其后为1557 cm^?1（+0.05302）、3318 cm^?1（+0.03543）、1454 cm^?1（+0.02740）、1239 cm^?1（+0.02646）和1032 cm^?1（+0.02071），CH₂伸缩区约2921和2852 cm^?1呈较小负载荷；PC2最大绝对载荷约在1631 cm^?1（?0.07361）和1538 cm^?1（?0.06686），其后约1236 cm^?1（?0.03726）、1450 cm^?1及3394 cm^?1附近的OH/NH伸缩区正特征。两因素重复测量ANOVA显示，PC1的膜层主效应显著（F(1, 2) = 329.49，p = 0.003），处理主效应（F(1, 2) = 5.49，p = 0.144）及处理×膜层交互（F(1, 2) = 1.07，p = 0.409）不显著；PC1均值上皮层为1.125 ± 0.207，间充质层为?1.125 ± 0.148。PC2的处理（F(1, 2) = 0.02，p = 0.896）、膜层（F(1, 2) = 5.73，p = 0.139）及交互（F(1, 2) = 2.15，p = 0.280）均不显著。结论为可检测的主要多变量差异与膜层内在组织相关，而非PAW或ATB处理。

讨论部分总结：PAW具有强抗菌活性，但其与生物材料相互作用的认识存在空白，因此该研究以组织学观察和FTIR分析比较ATB与PAW洗涤后AM的结构完整性。组织学结果显示两种洗涤均未改变AM结构层；讨论将其与庆大霉素和紫外线处理、伽马辐射所致上皮细胞丢失、胶原纤维崩解、基质空泡化等损伤进行对比。FTIR指纹区变化可能与PAW和细胞膜相互作用导致脂质氧化有关，但结合组织学无改变及多变量分析高度相似，原文认为这可能反映浅表分子重排而未显著损害AM结构；同时指出FTIR无变化不一定意味着组织学无变化，并引用伽马照射中FTIR未见显著变化而组织学出现损伤的例子。HCA在Amide I/II区未显示ATB与PAW分离，提示AM蛋白结构组织未发生显著改变；本研究中Amide I峰强度在PAW组与ATB组相似，也与HCA结果一致。PCA与HCA未发现PAW洗涤导致膜改变，唯一可观察差异为PCA可区分AM层，符合AM具有上皮层与间充质/基质层分区的分层组织；PC1为主要变异驱动因素，前四个成分解释97.99%变异，说明数据集主要由膜层固有差异而非处理决定。载荷区域与AM中蛋白相关振动相符，包括Amide I、Amide II、Amide III、CH弯曲及NH/OH伸缩等。讨论强调，处理效应在PC1和PC2均无统计学显著，PAW与ATB样本重叠应解释为在所评估条件下未检测到处理相关位移，而不能作为PAW与ATB等效的证据。PAW的活性氧氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, RONS）可积累或降解蛋白，在活组织中亦与刺激胶原合成和成熟相关；但本研究中组织学和FTIR未显示PAW洗涤后ECM或上皮层蛋白架构改变，提示所用实验条件下PAW暴露不足以诱导可检测的AM蛋白结构修饰。该结果支持PAW作为基于RONS作用的非抗生素替代用于AM处理。局限包括供体变异和生物样本数有限、未纳入微生物学/力学/生化检测、未设未处理膜对照（因临床AM使用前需加工和保存），未来需补充相关评估和适当对照。

研究结论（译文）：在本研究中，观察到用PAW洗涤AM未改变其组织学架构，保留了上皮层和ECM。虽然FTIR分析显示指纹区存在变化，具体在Amide III带，但上皮层1035 cm^?1峰强度增加可能归因于膜冷冻保存时使用的残留甘油，而非PAW处理。多变量分析（PCA和HCA）确认光谱变异主要与膜的上皮层和间充质层之间的固有差异相关，实验组间未观察到区分。总体而言，这些发现表明PAW洗涤AM后未检测到主要组织学和生化改变。