基于多参数UV–vis荧光光谱的316L不锈钢表面植物源蛋白残留检测与界面吸附表征

《Advanced Materials Interfaces》：Multi-Parametric Fluorescence Spectroscopy for the Detection and Characterization of Plant-Derived Protein Residues on 316L Stainless Steel

　　

蛋白质和其他生物分子在不锈钢及其他功能性金属表面的吸附是食品加工环境中的关键界面现象，会导致有机残留物在表面逐步积累。这些残留物的存在会损害材料性能、促进微生物黏附、使清洗程序复杂化，并最终带来显著的卫生挑战。本研究评估了UV–vis荧光光谱（UV–vis fluorescence spectroscopy）在监测植物源生物分子于AISI 316L不锈钢（AISI 316L stainless steel）表面吸附方面的适用性，所用体系为人工自来水（artificial tap water, ATW）中的米蛋白浓缩物（rice protein concentrate, RPC），并考察了硬脂酸（stearic acid, SA）和NaCl存在与不存在的条件。基于多高斯峰解卷积（multi-Gaussian peak deconvolution）并结合贝叶斯信息准则（Bayesian Information Criterion, BIC）评价，对仪器参数进行了优化。该方法能够稳健分辨重叠光谱特征，并提高复杂基质中的灵敏度。通过分析荧光峰位移和强度变化来探测蛋白质–合金表面相互作用，为蛋白质诱导的光谱变化以及蛋白质吸附所提出的构象转变提供诊断指标。结果表明，荧光光谱是监测食品加工条件下不锈钢界面蛋白质吸附和残留积累的有价值技术。总体而言，研究结果为食品加工系统中的卫生控制策略和材料性能优化提供了相关见解。

研究背景方面，不锈钢（以316L为主）广泛用于食品加工设备，并反复接触化学组成和性质各异的食品。受营养、环境和可持续性因素驱动，食品体系正由动物源向植物源转变，但植物基食品与金属表面相互作用的知识仍有限。蛋白质等生物分子吸附会导致有机残留逐步积累，即食品结垢，并可能改变表面特征和氧化层性质，进而影响微生物结垢、清洗效果和设备长期性能，还关联微生物黏附和残留致敏物等食品安全问题。已有蛋白吸附研究多集中于牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、酪蛋白以及乳清和大豆蛋白等，植物源蛋白与金属表面相互作用尤其是米源生物分子仍研究不足。尽管有标准清洗程序，不锈钢表面仍会形成蛋白质沉积，因此需要快速、可重复且成本有效的分析手段监测此类残留。研究人员据此评估UV–vis荧光光谱（UV–vis fluorescence spectroscopy）用于检测和表征ATW中RPC在316L不锈钢（stainless steel, SS）表面吸附所诱导的光谱效应，并考察SA、NaCl和暴露时间的影响。研究结论表明，荧光光谱可作为监测食品加工条件下不锈钢界面蛋白吸附和残留积累的有价值技术，为卫生控制和材料性能优化提供依据。

关键技术方法方面，研究人员使用316L不锈钢试样（由Outokumpu AB提供）和QCM 316L传感器（由Bergman Labora提供），RPC购自Holistic Sweden AB（含>80%蛋白）；以按EN 16889配制的人工自来水（ATW）为基液，设置0、24、48 h暴露及未冲洗/冲洗状态；采用FS5荧光光谱仪，激发波长281 nm，并优化Δλ_step、t_dwell、ExBW和EmBW；以多高斯解卷积和贝叶斯信息准则（BIC）选模型，计算信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）；辅以原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）、衰减全反射/傅里叶变换红外光谱（attenuated total reflectance/Fourier transform infrared spectroscopy, ATR/FTIR）、X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）和纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）；统计采用Z检验和Benjamini-Hochberg错误发现率（false discovery rate, FDR）校正。

研究结果如下。3.1 不锈钢试样表征（Coupon Characterization）：通过AFM、FTIR和XPS多模态表征RPC暴露前后SS表面，AFM显示暴露后形成直径100–500 nm、局部高度达120 nm的颗粒状膜；FTIR显示暴露后仍保留RPC的酰胺I、II、III及C─O/C─N伸缩等特征峰，但峰位向低cm^?1移动；XPS显示暴露表面碳、氮丰度增加，N 1s出现N-OR_RPC（有机来源）峰和N-OR_surf峰。结论是RPC吸附为稳定成膜过程而非瞬态物理附着，蛋白天然二级结构在接触SS钝化层后部分重排，静电吸引、酰胺羰基与钝化氧化物直接配位以及芳香残基π堆积可能贡献膜稳定性，且该锚定机制对脂肪酸竞争吸附较稳健。3.2 实验参数优化（Optimization of Experimental Parameters）：以未暴露SS表面为基线，测试60种仪器配置，结合SNR、拟合优度R²、BIC和Pearson相关分析，选择兼顾光谱分辨率、信噪比和采集时间的参数：Δλ_step为2 nm、t_dwell为1 s、ExBW为2 nm、EmBW为3 nm；BIC用于惩罚模型复杂度，37/60配置中7峰高斯模型为统计最优。结论是建立了稳健的荧光检测协议并降低过拟合风险。3.3 ATW基液和RPC基溶液的荧光表征（Fluorescence Characterization of the ATW-based and RPC-based Solutions）：通过荧光光谱表征基液和RPC溶液，ATW基液主要由308 nm水拉曼散射峰主导，NaCl使峰面积略增，SA使308 nm峰面积分别降低约23%和27%（SA与SANaCl）；RPC溶液在292–400 nm呈复杂峰群，强度趋势为RPCNaCl > RPCSA > RPC > RPCSANaCl；6峰模型显示水拉曼峰、4个色氨酸（tryptophan）驱动跃迁和约302 nm低强度峰，并对应约322、342、360和377 nm的色氨酸类别/聚集体状态；NaCl使I、II、III类色氨酸峰蓝移，SA和SANaCl使其红移；动力学符合一级指数衰减，沉降慢且平台值未低于初始强度的90%。结论是RPC荧光反映蛋白结构并对介质敏感，24和48 h暴露实验有效。3.4 不锈钢表面的荧光（Fluorescence of the Stainless Steel Surfaces）：通过24和48 h暴露后未冲洗与冲洗SS试样的荧光光谱及7峰高斯解卷积，发现SS基底自身荧光在305、313、326、350、367、382和391 nm附近主导光谱并掩盖RPC特征；但峰参数分析显示，低波长组（约305、313、326 nm）在所有暴露试样中红移，幅度和面积总体增加，冲洗后更明显；中高波长组（约350、367、382 nm）蓝移，幅度和面积下降或稳定，且几乎不受冲洗影响；391 nm峰无一致显著趋势。能量分析显示RPCSA暴露试样红移最明显，与其沉降最快、24 h近饱和一致，RPCNaCl和RPCSANaCl持续增至48 h；RPCSANaCl48冲洗后总面积仍高于对照，显示NaCl与SA的协同稳定。作者提出双层模型工作框架：红移峰（ΔE < 0）可能反映松散水合外层及局部氧化/金属离子（如Fe^2+/3+或Cr³⁺）相关电荷转移，易被冲洗去除；蓝移峰（ΔE > 0）可能代表直接锚定于SS界面的薄而致密初级蛋白层，表面诱导部分变性/展开使局部介电常数降低、疏水性增加，并在24 h内建立稳定结构。结论是FS可通过峰位移和面积变化定性至半定量区分蛋白残留层状态。

讨论部分总结：SS基底内在荧光强烈掩盖蛋白特征，直接分辨和绝对质量定量受限，因此FS是定性至半定量的诊断工具，通过统计解析的峰能、峰面积和强度扰动间接检测吸附；与QCM-D或XPS等低检测限但需特殊基底或超高真空的技术相比，FS灵敏度较低，但具备无标记、快速、适用于广泛真实试样几何、粗糙度和非透明工业材料的优势，可作为筛查手段而非替代重量分析工具。双层模型仍需深度剖析技术验证；静态高蛋白负载0–48 h是概念验证基准，实际食品加工常涉及动态流动、较低瞬时浓度和分钟至小时级初始吸附动力学。研究结论翻译：总之，研究结果证实UV–vis荧光光谱可作为强大且灵敏的工具，用于检测工业食品加工设备上吸附的植物源蛋白残留所诱导的光谱效应。除简单检测外，该方法提供蛋白残留潜在构象状态和吸附持久性信息的能力，为优化食品工业未来清洗就地（cleaning-in-place）方案提供有价值的诊断数据。