零出芽（Bd0）状态在II期结直肠癌中的分子病理基础与临床应用：辅助化疗降阶梯的新兴生物标志物

《The Journal of Pathology: Clinical Research》：The molecular pathological basis and potential clinical applications of ‘zero-budding’ status in stage II colorectal cancer

在II期结直肠癌（CRC）的个体化管理中，传统TNM（Tumor, Node, Metastasis）分期对术后复发风险进行准确分层的能力有限。因此，肿瘤科医师在决定这些患者是否接受辅助化疗时经常面临重大治疗困境。尽管肿瘤出芽（TB）已作为与侵袭潜能相关的独立预后标志物纳入国际临床指南，但传统国际肿瘤出芽共识会议分类系统主要基于常规苏木精-伊红（H&E）染色。此外，该框架将0–4个出芽的肿瘤归入单一低风险类别Bd1。这种分类可能掩盖完全无细胞解离的肿瘤与已显示早期侵袭活性的肿瘤之间的重要生物学差异。本综述提出对“零出芽”（Bd0）类别进行单独的诊断识别。近期大规模队列研究和回顾性分析支持，Bd0状态，尤其是经泛角蛋白免疫组织化学（IHC）确认时，与术后复发极高的阴性预测值（NPV）相关。在亚细胞水平，Bd0类别可能反映上皮-间质转化（EMT）过程的持续抑制。在机制上，这种相对非侵袭性类别可能通过EBP50支架的保留来维持，该支架稳定膜性E-cadherin/β-catenin复合物并抑制Wnt/β-catenin的核转位。Bd0还与错配修复缺陷（dMMR）微环境强相关，其中高肿瘤突变负荷可能促进增强的CD8⁺ T细胞介导的免疫监视，从而在形态学出芽可被检测之前清除播散性肿瘤细胞。本综述总结TB评估的演变，回顾支持Bd0的现有临床证据，评估新兴诊断方法，并讨论潜在分子机制。

Introduction：在CRC精准病理和预后评估中，形态学标志物逐渐从宏观解剖转向微观分子生物学；传统TNM分期对早期和中期疾病生存预测及干预分层存在局限。过去十年，TB成为CRC独立、可重复的不良预后因素，并纳入第8版UICC/AJCC CRC分期预后框架。ITBCC（International Tumor Budding Consensus Conference）2016系统在0.785 mm²热点区域将TB密度分为Bd1（0–4个）、Bd2（5–9个）、Bd3（≥10个）。大规模队列和分子病理技术显示传统阈值分类在精准医学时代存在分层准确性不足；Bd0新概念将完全无出芽与Bd1低危区分，作为与极佳结局相关的独立预后指标，可能重塑II期CRC临床决策。本综述系统总结TB评估演变、Bd0临床证据、检测方法和分子机制。

Clinical pain points: the adjuvant chemotherapy dilemma in stage II CRC：II期CRC（T3N0M0或T4N0M0）管理争议大；根治性手术R0切除后约15–20%患者5年内仍发生局部复发或远处转移。辅助化疗需在生存获益与毒性之间平衡，常用氟嘧啶单药或FOLFOX/CAPOX。NCCN/ESMO等指南主要依据高危临床病理因素推荐辅助化疗，包括T4、穿孔或梗阻、淋巴结检出<12枚、低分化/未分化、淋巴血管侵犯、神经周围侵犯（PNI），以及Bd3。但多因素风险分层预后特异性和预测准确性有限：部分“低危”患者仍复发，部分“高危”患者接受3–6个月化疗后毒性明显而无显著生存获益；低/中危II期患者氟尿嘧啶或奥沙利铂方案绝对获益约3–5%。奥沙利铂相关神经毒性可长期存在，MOSAIC长期随访显示>90%接受奥沙利铂方案者出现不同程度神经毒性，治疗结束4年后15.5%仍有慢性感觉神经病、感觉异常或运动障碍。因此，识别高NPV的分子或形态学标志物至关重要；Bd0可能提示间质侵袭和远处播散潜能显著降低，为安全豁免辅助化疗、减少过度治疗和优化资源分配提供依据。

Data-driven discovery and clinical evidence for the ‘zero-budding’ (Bd0) concept：ITBCC 2016阈值主要基于人群水平预后分层的统计模型，但Bd1将完全无TB（0个）与少量TB（1–4个）合并。Zlobec等2021年959例CRC回顾研究将Bd1细分为Bd0和1–4个出芽的Bd1^*，Bd0占11.6%（111/959）；Bd0在pT1病变中占46.3%，随浸润深度增加而出芽比例升高；Bd0较Bd1^*与更低pT、更早TNM、更好组织学分化及更低淋巴管、静脉和PNI侵犯率相关（p < 0.01）。Secinti等2022年131例结直肠腺癌采用H&E联合泛角蛋白IHC双评估，Bd0占23.7%（31/131），与更低pT、更早AJCC分期、更低组织学分级和更少淋巴结转移相关；Bd0患者总生存（OS）显著长于Bd1^*（log-rank p = 0.018）。Pihlmann Kristensen等2024年基于人群的493例II期CRC根治性切除队列系统应用泛角蛋白IHC，中位随访6.7年，21例为Bd0，随访期间IHC确认Bd0者复发率为0%，即复发无病生存NPV达100%；多变量Cox模型调整T分期、dMMR和组织学亚型后，任何程度TB（出芽数>0）仍与更差预后独立相关，复发风险HR = 5.19（95%CI，p = 0.02），全因死亡HR = 4.47（p = 0.04）。另一结合自噬标志物LAMP1/2和BECLIN1的队列中，Bd0占2.4%，长期无病生存更佳。证据提示Bd0向Bd1转变不仅是出芽数量增加，而可能是肿瘤进展的生物学转变；TB被视为EMT形态表现，Bd0可能保留上皮黏附结构，缺乏解离侵袭性单细胞或小簇。

Pathological assessment of TB: combined use of H&E staining and pan-cytokeratin IHC：ITBCC 2016基于H&E普及性、成本和标准化工作流将H&E确立为TB评估国际标准；但Bd0需高NPV时H&E敏感性不足。H&E对孤立肿瘤细胞或微小细胞簇检测有限，观察者间差异明显；侵袭前沿TME重塑、促结缔组织增生和炎症浸润中，癌相关成纤维细胞、组织细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及凋亡、坏死或处理伪影可形态学模仿肿瘤出芽，400×高倍下主观性增加。单纯H&E评估TB的Cohen kappa约0.64，属中等一致性。泛角蛋白（如AE1/AE3）IHC可与上皮细胞胞质角蛋白中间丝网络特异结合，在复杂间质背景中突出孤立肿瘤上皮细胞；Koelzer等双队列（回顾150例、前瞻236例）由17名病理学家评估，10个最高密度高倍视野的ICC为0.83–0.91。IHC可排除炎症或成纤维细胞聚集所致假阳性，并检测被炎症细胞或致密胶原遮蔽的真性微出芽；Kristensen等2024年同队列显示IHC检出出芽绝对数显著高于H&E（p < 0.01），观察者间kappa由0.64升至0.68–0.76。Bd0判定需在DAB棕色或AEC红色显色系统中确认间质背景无上皮特异性染色；IHC提高Bd0判定能力，但尚无统一IHC阈值，且增加成本、周转时间和工作量；在II期CRC中避免不必要辅助化疗可能带来成本效益。

Multidimensional molecular mechanisms underlying the Bd0 category in TB：Bd0作为独立临床病理类别提示需从基因组、表观遗传和转录调控层面理解；TB缺失或激活可能并非随机事件，而是特定分子类别及肿瘤微环境转录调控状态在组织空间结构中的表现；多组学交叉验证提示Bd0与多条核心生物学机制和信号网络相关。

DNA deficient mismatch repair (dMMR) and formation of the dual physical–immune barrier at the pushing border：微卫星不稳定（MSI）及相关dMMR约占散发性CRC的15%。dMMR/MSI-H肿瘤常呈“推挤性边界”，肿瘤细胞以膨胀、黏附性巢团生长，对周围组织形成钝性集体机械压力，肿瘤实质与间质间界面较光滑，单个上皮细胞解离或脱落少；Bd0在dMMR肿瘤中更常见。Jass等研究提示散发性MSI-H CRC的APC体细胞突变频率低、TB活性低，而MSS肿瘤更常见APC截短突变和高TB。免疫机制上，dMMR导致DNA复制错误修复能力丧失，TMB升高，产生移码肽等高免疫原性新抗原，招募CD8⁺细胞毒性T细胞、Th1极化CD4⁺辅助T细胞和FoxP3⁺调节性T细胞等肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）；侵袭前沿形成密集免疫屏障，单个肿瘤细胞脱离巢团后暴露于富含IFN-γ的细胞因子环境，并被周围CD8⁺ T细胞通过颗粒酶B和穿孔素诱导凋亡清除，从而在形态学出芽可检测前限制新生出芽。结构上，dMMR肿瘤中基底膜完整性和细胞外基质（ECM）侵袭相关蛋白改变；Shinto等提示Laminin-5 γ2链在dMMR CRC中显著下调，其异常过表达和蛋白酶切与MMP-2/MMP-9激活、胶原丰富ECM降解及侵袭迁移相关；dMMR中Laminin-5 γ2基因启动子高甲基化可能表观抑制该侵袭相关蛋白，限制TB，解释dMMR肿瘤低出芽Bd0、较低淋巴结和远处转移率及较好OS，且氟尿嘧啶辅助化疗获益有限。

Subcellular redistribution of the Wnt/β-catenin signaling pathway and EMT：TB被视为EMT的组织形态表现，经典Wnt/β-catenin通路异常激活是核心调控事件。正常肠上皮和高分化Bd0 CRC中，β-catenin主要位于细胞膜，与跨膜E-cadherin胞内域及肌动蛋白骨架形成黏附连接，维持上皮细胞群体极性。Bd2/Bd3侵袭缘存在β-catenin空间异质性：细胞黏附丢失后β-catenin从膜复合物解离，逃逸泛素介导降解，胞质积累并核转位；El-Gendi和Gao等队列显示肿瘤中心以膜性强表达为主，侵袭前沿孤立出芽细胞胞质积累和核定位显著增加（p > 0.001）。核内β-catenin作为转录共激活因子与TCF/LEF转录因子家族形成复合物，激活SNAIL、Slug、TWIST和ZEB1/2等EMT转录调节因子，结合CDH1启动子抑制E-cadherin转录，破坏细胞间黏附并促进细胞解离和骨架重塑，形成TB。上游EBP50支架局部耗竭可能参与该过程：EBP50维持β-catenin膜稳定，密集TB侵袭前沿EBP50表达降低，PDZ结构域介导的分子互作网络破坏；NHERF1/EBP50通过ERM结合域连接ERM蛋白网络和皮质肌动蛋白骨架，PDZ1稳定β-catenin，锚定破坏后β-catenin从膜释放、核转位并上调Slug。Bd0肿瘤侵袭前沿维持EBP50空间稳态，保留E-cadherin/β-catenin连接复合物完整性，抑制EMT上游激活，限制细胞脱离和间质侵袭。

The unique characteristics of mucinous adenocarcinoma: differentiating true EMT-mediated invasion from passive pseudobudding：黏液腺癌按WHO标准以细胞外黏液池广泛积聚、无细胞黏液成分超过肿瘤体积50%为特征。高压黏稠黏液环境中，脆弱腺体结构受静水压持续作用而破裂，脱落肿瘤上皮细胞、小簇和孤立印戒样细胞被动散入黏液池；H&E下可被误判为高级别TB，称为假出芽。分子和转录组分析提示，经典Wnt/EMT通路驱动的真性间质侵袭性出芽及迁移和基质降解能力在纯黏液腺癌中相对少见。因此，Bd0界定需泛角蛋白IHC联合高分辨率图像分析；在排除切片伪影、严重炎症和黏液池物理破坏后，部分H&E看似丰富出芽的黏液腺癌经IHC可重分类为生物学惰性Bd0。区分EMT介导的间质侵袭与黏液池破裂所致被动细胞播散，对评估该亚型复发转移风险及指导随访和治疗策略重要。

The comparison of Bd0 and other stage II CRC management biomarkers：Bd0与ctDNA、MSI/dMMR、Immunoscore和CMS等标志物相比，Bd0属形态表型，反映EMT相关出芽和侵袭活性缺失；标本为原发肿瘤FFPE切片，推荐泛角蛋白IHC，检测为常规光镜，技术可及性很高、成本很低、周转1–3个工作日；在II期CRC中提示极低复发风险，回顾性队列报告复发NPV 100%，可识别考虑省略辅助化疗的极低危亚组；局限为观察者依赖，IHC可提高可重复性。ctDNA反映分子残留病，需NGS或ddPCR，成本高、可及性较低，阳性支持治疗升级，持续阴性支持监测或降阶梯，但低脱落可假阴性，克隆性造血（CHIP）可干扰，连续监测成本高。MSI/dMMR反映基因组/蛋白表型，IHC或PCR可及性很高，dMMR在II期CRC通常预后较好，可支持部分患者省略氟尿嘧啶单药，但主要适用于MSI-H/dMMR约15–20%人群，对多数MSS患者风险分层有限。Immunoscore反映免疫微环境，需CD3和CD8免疫染色及数字病理/AI分析，成本较高；低免疫评分合并高危特征可考虑强化治疗。CMS为转录组表达谱，需RNA-seq和生物信息聚类，可及性很低、成本很高、周转慢，CMS4与转移风险和不佳生存相关。总体而言，Bd0基于常规病理和CKPan IHC，技术可行性和成本优势明显，并可能跨分子亚型提供补充风险分层，但需前瞻验证后才能独立用于支持省略化疗。

Multidimensional integration of TB with emerging immune and digital biomarkers：空间转录组（ST）、多重免疫荧光（mIF）和人工智能（AI）数字病理推动TB预后研究从人工显微镜计数转向多组学数字范式。TB与宿主抗肿瘤免疫标志物如Immunoscore整合可增强预后价值；Haddad等2024年研究纳入654例pTNM I–III期CRC，以深度学习网络自动量化TB密度并整合侵袭缘和肿瘤核心CD3⁺、CD8⁺ T细胞免疫评分，两独立参数与复发HR分别约2.0和2.5相关；高免疫评分联合Bd0或极低出芽者预后最佳，淋巴结转移率13.8%，微淋巴管和静脉侵犯少，长期无病生存好。Liang等提示即使TB有限，出芽细胞分子特征仍影响结局；残余微出芽中KRT17异常高表达与周围成熟T淋巴细胞密集浸润空间相关，形成“免疫热TB”，高KRT17 TB与较好长期生存相关。AI方面，CNN和cGAN等可从大量注释全切片图像中自动识别、勾勒和量化AE1/AE3标记的孤立肿瘤细胞，微米级精度，减轻病理医师工作量和视觉疲劳，并可对连续病理数据建模，建立连续预后模型，加速“绝对Bd0”转化。临床转化需审慎：AI联合H&E评估TB可能成本效益较高，基于UNI等基础模型可从低成本数字H&E识别Bd0和Bd1–3；mIF提供空间免疫信息但受光谱串扰、试剂成本和周转时间限制；ST机制价值高但FFPE RNA降解、脱靶探针和计算需求限制常规应用。未来可行策略可能是常规H&E联合CD3、CD8、PD-L1等有限免疫标志物的低plex多重荧光或显色染色，再由AI整合免疫梯度与TB密度生成空间预后信息。

Limitations：本综述纳入研究完全基于回顾性设计，缺乏前瞻性验证和随机对照试验（RCT）；目前尚无临床指南支持Bd0亚型独立分类。现有文献Bd0队列较小，需在扩大人群中验证，并普遍缺乏外部验证；纳入研究间存在评估方案异质性和CRC复发定义不一致；不能排除潜在发表偏倚。因此，未来需大规模、多中心前瞻性研究和RCT验证相关结论。

Future perspectives：TB评估系统反映临床肿瘤学从表层形态描述向疾病进展分子基础研究的演变。基于H&E的Bd1/Bd2/Bd3三级系统对人群水平预后分层有价值，但在个体化临床决策尤其II期CRC术后辅助化疗必要性判断中，敏感性和NPV仍有限。建议在辅助化疗指征仍有争议的II期CRC中系统实施泛角蛋白IHC辅助的高精度TB评估，并在未来临床病理指南中将Bd0识别为独立生物学亚组。Bd0可采用泛角蛋白IHC判定，以减少急慢性炎症、活化成纤维细胞增殖、ECM重塑和黏液池物理破坏所致形态学混淆；应由两名经验丰富病理学家或经验证的AI辅助图像分析系统确认肿瘤侵袭前沿完全无散在单克隆或寡克隆上皮细胞簇。以此病理“金标准”诊断的II期CRC Bd0患者约占10–24%（依队列而定），长期随访复发风险接近零，提示该亚组接受不必要的全身辅助化疗可能仅带来累积毒性而无显著临床获益。识别这一真正极低危亚组并豁免常规辅助化疗，符合现代精准医学以患者为中心的目标，即最大化生活质量并减少身心负担，也可能从卫生经济学角度减少昂贵全身治疗过度使用及治疗相关并发症（如神经病变康复和骨髓抑制支持治疗）的医疗支出。