外周神经系统乳酸代谢紊乱导致运动选择性缺陷

《GLIA》：Disruption of Lactate Metabolism in the Peripheral Nervous System Leads to Motor-Selective Deficits

　　

施万细胞（Schwann cells, SCs）为外周神经系统（peripheral nervous system, PNS）中的轴突提供髓鞘化和营养支持。施万细胞代谢紊乱可导致脱髓鞘和轴突变性，这是外周神经病变的主要缺陷。乳酸穿梭假说（lactate shuttle hypothesis）提出，糖酵解支持细胞向轴突供应乳酸，以维持其高代谢需求。这一转运过程需要施万细胞和神经元中的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）催化乳酸与丙酮酸之间的相互转化。为验证乳酸代谢在外周神经系统中的重要性，研究人员在胆碱能（ChAT阳性）神经元（包括运动神经元（motor neurons, MNs））、Nav1.8谱系感觉神经元（sensory neurons, SNs）或施万细胞中分别选择性敲除LDHA和LDHB基因。有趣的是，当LDH从运动神经元或施万细胞中删除时，运动轴突及其突触进行性退化；但当LDH从感觉神经元或施万细胞中删除时，Nav1.8谱系感觉轴突及其末梢未观察到缺陷。施万细胞中LDH缺失导致外周神经中ATP减少，尽管丙酮酸和糖酵解中间产物显著积累，这与丙酮酸向乳酸转化失败导致的能量缺陷一致。利用核糖体亲和 profiling（RiboTag）进行的胆碱能神经元特异性基因表达分析发现，LDH缺陷神经元通过激活轴突损伤应激程序对代谢受损产生强烈反应。最后，通过SARM1缺失阻断LDH缺陷小鼠的轴突变性，可保留轴突形态，但未能改善行为和电生理缺陷，表明乳酸缺乏的轴突虽然保持物理完整但功能下降。这些结果表明，运动轴突与感觉轴突对施万细胞来源乳酸的依赖性存在差异，提示乳酸可用性可能影响运动神经元疾病的病程。

研究背景与问题

外周神经系统（PNS）中，施万细胞（SCs）是主要的支持细胞，通过髓鞘化和营养支持维持轴突功能与健康。施万细胞代谢紊乱可导致脱髓鞘和轴突变性，这是外周神经病变的核心病理特征。乳酸穿梭假说提出，糖酵解支持细胞（如施万细胞和星形胶质细胞）主动产生乳酸并将其转运至神经元，以补充其高代谢需求。乳酸进入轴突后可转化为丙酮酸，进而被线粒体利用产生ATP并合成大分子。该代谢偶联机制在中枢神经系统（CNS）中已得到充分证实，而外周神经系统中的关键证据也逐渐积累。例如，髓鞘形成施万细胞依赖由丙酮酸激酶M2（PKM2）驱动的特化糖酵解程序来产生和输出乳酸；施万细胞储存糖原而轴突不储存；施万细胞中缺乏PKM2或乳酸转运体MCT1的小鼠会出现轴突和神经肌肉接头（NMJ）缺陷。然而，MCT1缺陷并不能完全消除施万细胞向轴突的乳酸穿梭，提示存在其他乳酸转运机制。乳酸脱氢酶（LDH）是催化丙酮酸与乳酸相互转化的关键酶，功能性LDH由LDHA和LDHB两种亚基组合形成的四聚体构成。由于该相互转化的平衡取决于底物浓度，必须同时删除LDHA和LDHB才能消除LDH活性。此前研究尚未明确乳酸代谢在外周神经变性中的具体作用，特别是运动与感觉轴突对施万细胞来源乳酸的依赖性是否存在差异。因此，研究人员通过遗传学手段靶向删除不同细胞类型中的LDH，以探究施万细胞乳酸产生对轴突维持的影响。

研究内容与结论

研究人员利用Cre-lox系统，将Ldha/Ldhb floxed小鼠与ChAT-Cre（胆碱能神经元包括运动神经元）、Nav1.8-Cre（感觉神经元）或MPZ-Cre（施万细胞）小鼠交配，分别生成运动神经元LDH敲除（MNKO）、感觉神经元LDH敲除（SNKO）和施万细胞LDH敲除（SCKO）小鼠。研究发现，MNKO小鼠在6月龄出现显著肌无力，至12月龄进展为更严重的运动功能障碍，股神经中总轴突数量减少，大直径轴突显著丢失，变性轴突增多，并伴有再生簇和洋葱球形成。SNKO小鼠在热刺激和机械刺激反应、感觉神经动作电位（SNAP）振幅和传导速度方面均无异常，腓肠神经形态正常。SCKO小鼠表现出进行性肌力下降，坐骨神经中ATP显著减少，尽管丙酮酸和糖酵解中间产物显著积累。SCKO小鼠的腓肠神经（感觉神经）无明显异常，而股神经（运动神经）中轴突显著减少，剩余轴突以小直径为主，并出现大量变性轴突、再生簇、洋葱球和裸露轴突。SCKO小鼠的蚓状肌中神经肌肉接头显著去神经支配，肌肉纤维横截面积减小。通过RiboTag技术对胆碱能神经元进行转录组分析发现，LDH缺陷神经元中Fgf21（应激诱导的有丝分裂因子）、Atf3和Sprr1a（经典轴突再生相关基因）显著上调，提示代谢受损激活了轴突损伤应激程序。利用Sarm1敲除阻断轴突变性后，虽然轴突形态和髓鞘厚度得以保留，神经炎症显著减少，但运动行为和电生理缺陷并未恢复，表明乳酸缺乏的轴突即使保持物理完整也存在功能缺陷。这些结果表明，运动轴突比感觉轴突更依赖施万细胞提供的乳酸来满足代谢需求，Nav1.8谱系感觉轴突可能使用其他代谢途径维持功能。

主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：1）Cre-lox条件性基因敲除技术，通过ChAT-Cre、Nav1.8-Cre和MPZ-Cre分别靶向运动神经元、感觉神经元和施万细胞；2）RiboTag核糖体亲和纯化技术结合RNA-seq，用于分析胆碱能神经元特异性转录组；3）¹³C₆-葡萄糖标记的代谢流分析（LDH flux assay），用于追踪乳酸来源；4）液相色谱-质谱联用（LC-MS）稳态代谢组学分析，用于测量糖酵解代谢物和ATP水平；5）光镜和电镜形态学分析，用于评估轴突和髓鞘结构；6）行为学测试（倒挂屏测试、抓力测试、Von Frey测试、尾甩测试）和神经电生理记录（CMAP和SNAP）；7）RNA原位杂交（RNAscope）验证基因表达；8）坐骨神经挤压损伤模型评估再髓鞘化能力。实验动物为C57BL/6N背景的混合遗传背景小鼠，所有实验均以Cre阴性同窝小鼠作为对照。

研究结果

3.1 运动神经元而非感觉神经元需要LDH维持轴突完整性：通过行为学测试和形态学分析发现，MNKO小鼠出现进行性运动功能障碍和股神经轴突变性，而SNKO小鼠感觉功能和腓肠神经形态均正常，表明运动轴突对LDH缺失更为敏感。

3.2 LDH缺陷运动神经元的RNAseq分析揭示早期应激反应特征：利用RiboTag技术对2-3月龄MNKO小鼠脊髓胆碱能神经元进行转录组分析，发现Fgf21、Atf3和Sprr1a等应激和再生相关基因显著上调，Slc16a4（编码MCT5）也上调，提示代谢受损激活了轴突损伤应激程序。

3.3 施万细胞LDH缺陷导致外周神经中丙酮酸向乳酸转化减少和ATP产生下降：代谢流分析显示SCKO神经中¹³C标记乳酸产生显著减少，稳态代谢组学发现丙酮酸、甘油醛3-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸等糖酵解中间产物积累，ATP水平显著降低，证实施万细胞LDH缺失导致乳酸耗竭和能量缺陷。

3.4 施万细胞LDH缺失导致进行性运动神经病变：SCKO小鼠表现出进行性肌力下降，坐骨神经和股神经出现进行性轴突变性、脱髓鞘、洋葱球、再生簇等神经病变特征，而腓肠神经（感觉神经）无明显异常，蚓状肌NMJ显著去神经支配，确认运动选择性缺陷。

3.5 乳酸缺乏导致功能性运动缺陷而施万细胞无内在转录重编程：通过Sarm1敲除阻断轴突变性后，虽然轴突形态和髓鞘厚度得以保留，神经炎症减少，但运动行为和电生理缺陷未恢复；转录组分析显示LDH SCKO与Sarm1 KO之间差异表达基因很少，表明LDH缺失未显著改变施万细胞生理状态。

讨论与结论

研究结果表明，运动轴突比感觉轴突更依赖施万细胞提供的乳酸来维持其结构和功能。SCKO小鼠中LDH缺失导致ATP减少和代谢物积累，而SARM1缺失虽能保留轴突形态但不能恢复功能，说明结构保留不能纠正潜在的代谢缺陷。MNKO和SCKO小鼠虽然都出现运动障碍，但表型特征不同：SCKO早期缺陷更明显，而MNKO后期更严重，这可能反映了两种模型干扰乳酸穿梭途径的不同环节。研究人员发现LDH缺陷运动神经元中Fgf21上调，这可能是一种适应性神经保护反应，与ALS模型中观察到的现象一致。研究还发现Slc16a4（MCT5）上调，提示LDH缺陷神经元可能获取替代代谢底物。研究局限性包括ChAT-Cre不限于躯体α运动神经元，Nav1.8-Cre仅覆盖部分感觉神经元亚群，因此阴性结果不应解释为所有感觉神经元对LDH缺失均不敏感。总之，在施万细胞或胆碱能神经元中破坏LDH活性导致运动选择性轴突和NMJ功能障碍，而Nav1.8谱系感觉神经元未出现类似异常，这些发现确定了LDH依赖性乳酸代谢对维持外周神经系统运动轴突功能的重要性，并提示乳酸可用性可能影响运动神经元疾病的病程。