《CNS Neuroscience & Therapeutics》：ATF3 Promotes Solasonine-Triggered Ferroptosis in Glioma Cells by Suppressing Glycolysis
编辑推荐：
中文翻译：
**背景**
胶质瘤细胞以快速增殖、高度侵袭性和显著异质性为特征。尽管近年来采用了多种治疗方案，胶质瘤的预后仍然较差。诱导肿瘤细胞发生铁死亡已成为一种有前景的治疗策略。澳洲茄碱（SS）是一种来源于茄科植物的甾体生物碱，具有多种抗肿瘤作用。然而，其
中文翻译：
**背景**
胶质瘤细胞以快速增殖、高度侵袭性和显著异质性为特征。尽管近年来采用了多种治疗方案，胶质瘤的预后仍然较差。诱导肿瘤细胞发生铁死亡已成为一种有前景的治疗策略。澳洲茄碱（SS）是一种来源于茄科植物的甾体生物碱，具有多种抗肿瘤作用。然而，其是否能够抑制胶质瘤生长及其作用机制尚未被研究。
**方法**
通过检测亚铁离子、活性氧和丙二醛的水平，分析了SS对胶质瘤细胞铁死亡的影响。使用蛋白质印迹法、免疫荧光法和共聚焦显微镜分析了激活转录因子3（ATF3）在SS诱导的胶质瘤细胞铁死亡中的作用。构建了胶质瘤小鼠体内模型以进一步研究SS的效果。
**结果**
研究人员发现，SS抑制了胶质瘤细胞的增殖并促进了其铁死亡。SS处理增加了细胞内亚铁离子、丙二醛和活性氧的水平。它通过调控ATF3来抑制糖酵解并抑制抗氧化系统，从而增加了细胞内过氧化氢的水平。升高的过氧化氢水平激活了核受体共激活因子4依赖的铁蛋白自噬，并增加了细胞内铁的水平。此外，SS通过抑制糖酵解激活了蛋白激酶RNA样内质网激酶/ATF4内质网应激通路，并促进了ATF3的表达。这一过程形成了一个正反馈回路。在小鼠模型中，SS通过诱导铁死亡显著抑制了胶质瘤细胞的生长。
**结论**
这些结果表明，SS通过ATF3抑制糖酵解，从而在体外和体内促进胶质瘤细胞的铁死亡。
论文解读
一、研究背景与科学问题
胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，其快速增殖和高度侵袭性生长导致手术难以完全切除，术后复发率高，预后差。尽管近年来采用手术、放疗和化疗等多种治疗手段，但恶性胶质瘤对化疗药物具有高耐药率，整体治疗效果不佳，亟需开发新型有效的治疗策略。诱导铁死亡作为一种铁依赖的、由脂质过氧化物蓄积驱动的细胞死亡形式，已被证实能有效杀伤肺癌、肝癌和脑胶质瘤等多种恶性肿瘤细胞。铁死亡的关键机制包括细胞内亚铁离子水平升高和脂质过氧化加剧。铁蛋白自噬通过溶酶体降解细胞内主要的储铁蛋白——铁蛋白，释放储存的铁离子，进而影响铁代谢和氧化应激水平。此外，胶质瘤细胞即使在氧气充足的情况下也倾向于依赖糖酵解为快速肿瘤生长提供能量，糖酵解抑制被认为是胶质瘤潜在的治疗策略。澳洲茄碱（SS）是从茄科植物中提取的甾体糖生物碱，具有抗菌、抗炎和抗肿瘤等多种药理活性，但SS能否通过诱导铁死亡抑制胶质瘤生长及其具体分子机制尚未阐明。本文通讯作者为吉林大学第一医院葛鹏飞与赵丽艳，该研究获得吉林省科技厅资助，旨在探讨SS通过激活转录因子3（ATF3）调控糖酵解影响胶质瘤细胞铁死亡的分子机制。
二、研究主要发现与结论概述
研究人员发现，SS以剂量依赖性方式抑制胶质瘤细胞增殖并诱导铁死亡。SS处理后细胞内亚铁离子、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）水平显著升高，并且升高的细胞内过氧化氢水平通过调控ATF3抑制糖酵解、削弱抗氧化系统，进而激活核受体共激活因子4（NCOA4）依赖的铁蛋白自噬，提高细胞内铁水平。同时，SS通过抑制糖酵解激活蛋白激酶RNA样内质网激酶（PERK）/ATF4内质网应激通路，促进ATF3表达，形成正反馈回路。在体内小鼠胶质瘤模型中，SS通过诱导铁死亡显著抑制了胶质瘤生长，在异位皮下和颅内原位肿瘤模型中均验证了这一机制。
三、主要关键技术方法
本研究采用的关键技术方法包括：CCK-8实验评估细胞活力并计算半数抑制浓度；蛋白质印迹法检测铁死亡、铁蛋白自噬、糖酵解及内质网应激相关蛋白表达水平；免疫荧光结合共聚焦显微镜观察ATF3胞质与胞核分布及线粒体超氧化物水平；使用化学荧光探针及微板读取器检测细胞内亚铁离子、ROS、MDA、GSH/GSSG、过氧化氢及ATP和丙酮酸水平；小干扰RNA（siRNA）转染敲低ATG5和ATF3以验证功能关联；体内实验采用BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型和NOD/SCID小鼠颅内原位胶质瘤模型，给药方案为腹腔注射低剂量（25 mg/kg）和高剂量（50 mg/kg）SS连续10天；肿瘤组织学分析采用H&E染色和免疫组织化学染色。体外细胞系包括U251MG（ECACC: 09063001）和T98G（ATCC: CRL-1690）人胶质瘤细胞系。
四、研究结果分述
（一）SS抑制胶质瘤细胞增殖并促进铁死亡
CCK-8检测显示SS以剂量依赖性方式降低胶质瘤细胞活力，T98G和U251细胞的半数抑制浓度（IC50）分别为36 μM和35 μM。铁死亡抑制剂去铁胺（DFO）、ferrostatin-1（Fer-1）和liproxstatin-1（Lip-1）预处理抑制了SS诱导的细胞死亡，而铁死亡激动剂枸橼酸铁铵（FAC）预处理则促进细胞死亡。SS处理后细胞内亚铁离子、ROS、MDA和GSH/GSSG水平显著升高，DFO、Fer-1和Lip-1预处理可降低这些指标。蛋白质印迹显示SS促进转铁蛋白和转铁蛋白受体（TfR）表达，提高细胞内亚铁离子和铁蛋白水平，同时抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和xCT的表达，导致ROS水平升高。
（二）ATF3参与SS诱导的胶质瘤细胞铁死亡
SS处理增加了胶质瘤细胞胞质和胞核中ATF3的表达，并伴随向核内转位。siATF3转染后细胞活力升高，亚铁离子、ROS、MDA和GSH/GSSG水平的升高均被削弱。siATF3转染还减弱了SS诱导的线粒体超氧化物水平升高。上述结果表明ATF3促进SS诱导的胶质瘤细胞铁死亡。
（三）ATF3通过调控铁蛋白自噬参与SS诱导的铁死亡
SS处理升高了自噬相关蛋白5（ATG5）、铁蛋白重链（FTH）和LC3-II的表达，降低了NCOA4和p62的表达，表明SS促进了铁蛋白自噬。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）和巴弗洛霉素A1（Baf-A1）以及siATG5处理均提高了细胞存活率，降低了亚铁离子、MDA和ROS水平，并抑制了铁蛋白自噬相关蛋白的变化。siATF3处理降低了ATG5表达。上述结果提示ATF3通过调控ATG5促进铁蛋白自噬，提高亚铁离子水平。
（四）ATF3通过抑制糖酵解升高过氧化氢水平促进铁蛋白自噬
SS处理以时间依赖性方式降低丙酮酸激酶M2（PKM2）、血小板型磷酸果糖激酶（PFKP）和己糖激酶2（HK2）的表达，表明SS抑制糖酵解。丙酮酸钠（SP）和三磷酸腺苷（ATP）预处理提高了细胞存活率，降低了亚铁离子、MDA和ROS水平，同时抑制了铁蛋白自噬相关蛋白的变化。SS还降低了GPX4、xCT和过氧化氢酶的表达，细胞内过氧化氢水平升高，SP和ATP预处理可逆转这一趋势。外源性过氧化氢处理直接升高了亚铁离子水平并促进铁蛋白自噬，而N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理抑制了SS促进的铁蛋白自噬。siATF3处理后，PKM2、PFKP、HK2、GPX4、xCT和过氧化氢酶的表达均升高，ATP、丙酮酸和过氧化氢水平也发生相应变化。
（五）SS通过抑制糖酵解产生的过氧化氢经正反馈调控ATF3表达促进内质网应激
SS和过氧化氢处理均以时间依赖性方式升高葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、PERK和ATF4的表达，而SP和ATP预处理抑制了SS诱导的内质网应激反应。内质网应激抑制剂4-苯基丁酸钠（4-PBA）预处理抑制了SS诱导的亚铁离子、MDA和ROS水平升高，以及GRP78、PERK、ATF4和ATF3的表达上调。
（六）体内实验结果
在BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型中，SS处理组肿瘤生长显著受抑，高剂量组肿瘤组织中MDA、亚铁离子和过氧化氢水平升高，GSH/GSSG水平降低。蛋白质印迹显示转铁蛋白、TfR、铁蛋白、ATF3、LC3-II、GRP78、PERK和ATF4表达升高，GPX4、xCT、p62、NCOA4、PKM2、HK2和PFKP表达降低。在NOD/SCID小鼠颅内原位模型中，H&E染色显示SS处理组肿瘤生长显著受抑，免疫组化结果显示NCOA4、GPX4和PKM2表达显著降低。
五、讨论与结论
本研究发现澳洲茄碱以剂量依赖性方式抑制胶质瘤细胞增殖，通过上调ATF3表达抑制糖酵解、升高过氧化氢水平，激活NCOA4依赖的铁蛋白自噬提高细胞内铁水平，并激活PERK/ATF4内质网应激通路促进ATF3表达形成正反馈回路，最终促进胶质瘤细胞铁死亡。这一机制在体内皮下和颅内模型中均得到验证。作为天然甾体糖生物碱，SS具有来源广泛、生产成本可控、多靶点活性及化学结构可修饰等优势，通过纳米递送系统和缓释制剂等策略可进一步改善其成药性。在胶质瘤治疗中，SS可作为一种新型铁死亡诱导剂，针对复发或难治性患者，通过绕过经典凋亡抵抗机制克服替莫唑胺耐药，并可联合放疗增强治疗敏感性。本研究结论部分指出，该研究阐明了SS通过ATF3诱导胶质瘤细胞铁死亡的机制，为胶质瘤治疗提供了新靶点和策略。未来仍需更多研究验证上述发现，通过结构修饰和药物递送系统设计提高SS的生物利用度和疗效，并探索SS与手术、放疗和化疗联合应用的综合治疗模式，为胶质瘤患者提供更有效、全面的治疗选择。
