mRNA与miRNA测序揭示乙醇加重结肠炎小鼠模型中氧化应激通路的增强

《Alcohol, Clinical and Experimental Research》：mRNA and miRNA Sequencing Identifies Increased Oxidative Stress Pathways in a Mouse Model of Ethanol Exacerbation of Colitis

　　

背景：饮酒已被发现可加重结肠炎病理。为阐明其机制，研究人员对酒精诱导结肠炎小鼠模型的大肠上皮细胞进行了miRNA（microRNA，微小RNA）和mRNA（messenger RNA，信使RNA）测序。方法：小鼠接受葡聚糖硫酸钠（DSS）5天以诱导结肠炎，并灌胃乙醇（~3 g/kg）或水3天。末次灌胃3小时后，小鼠被安乐死，测量结肠长度，随后分离上皮细胞。从结肠上皮细胞分离包括miRNA在内的RNA，并送至Novogene进行mRNA和miRNA测序。结果：比较DSS Ethanol vs. Sham Vehicle小鼠的分析显示3931个显著上调基因和3788个显著下调基因。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路的功能富集分析显示，超氧阴离子生成正调控和HIF-1（hypoxia-inducible factor 1，缺氧诱导因子1）信号通路富集，二者均与氧化应激相关。DSS Ethanol与DSS Vehicle相比导致921个显著上调基因和1072个显著下调基因（P_adj（校正P值）<0.05），功能富集分析显示倍数富集最高的术语是超氧阴离子生成。研究人员进一步证实了参与一氧化氮和超氧阴离子生成的NOS2（nitric oxide synthase 2，一氧化氮合酶2）、CYBB（cytochrome b-245 beta chain，细胞色素b-245 β链）和NCF1（neutrophil cytosolic factor 1，中性粒细胞胞质因子1）的RNA表达。miRNA测序显示，DSS Ethanol与DSS Vehicle比较有84个差异表达miRNA。这些miRNA预测靶标的功能富集分析也显示超氧阴离子生成富集。结论：这些结果提示，乙醇与DSS联合暴露可能增加活性氧（ROS）的产生，从而进一步损伤肠黏膜，并可能促进乙醇加重结肠炎。

研究背景与科学问题：炎症性肠病（IBD，inflammatory bowel disease）是胃肠道慢性炎症性疾病，估计影响240万美国人，每年新诊断超过56000例；主要包括克罗恩病（CD，Crohn's disease）和溃疡性结肠炎（UC，ulcerative colitis）。UC炎症连续、限于结肠，并多局限于黏膜层。现有治疗以控制疾病活动（flares）为主，包括氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫调节剂、JAK抑制剂和生物制剂，但部分患者无应答、未达缓解，且免疫抑制和耐药限制治疗选择。IBD病因未明，涉及遗传与环境因素；全基因组关联研究（GWAS）发现约240个易感位点，miRNA差异表达及miRNA模拟物或抑制剂可改善DSS小鼠肠道炎症。西方饮食中酒精是可能加重UC的因素；美国54%成人饮酒，IBD患者饮酒量与一般人群相近；酒精破坏肠上皮细胞（IEC，intestinal epithelial cell）屏障、降低紧密连接蛋白、增加肠道通透性和“leaky gut”，影响微生物组导致细菌过度生长和菌群失调，高饮酒UC患者复发风险增加。研究人员前期报道乙醇可加重DSS结肠炎小鼠病理，但机制不清，因此对大肠IEC进行mRNA和miRNA测序，以明确氧化应激和缺氧相关通路的作用。

研究人员开展的研究、结论和意义：研究人员建立DSS诱导结肠炎后乙醇灌胃小鼠模型，结合mRNA和miRNA测序、qPCR验证，并用患者结肠黏膜活检RNA队列验证靶基因。结论是DSS+乙醇小鼠IEC中ROS和活性氮（RNS，reactive nitrogen species）产生相关基因NOS2、CYBB、NCF1升高，miRNA预测靶标也富集于超氧阴离子生成；提示乙醇与DSS联合暴露可能增加ROS产生，损伤肠黏膜，并促进乙醇加重结肠炎。意义在于提供酒精影响结肠炎的新机制线索，将miRNA调控与氧化应激通路联系起来。

关键方法概述（不超过250字）：采用8–9周龄C57BL/6小鼠，随机分为SV（Sham Vehicle，假处理溶媒组）、SE（Sham Ethanol，假处理乙醇组）、DV（DSS Vehicle，DSS溶媒组）、DE（DSS Ethanol，DSS+乙醇组）；2% DSS饮水5天诱导结肠炎，第5–7天灌胃乙醇（~3 g/kg）或水，末次灌胃3小时后安乐死，测体重变化和结肠长度，分离大肠IEC。提取总RNA（含miRNA），送Novogene行mRNA和miRNA测序；HISAT2/Bowtie比对，DESeq2分析差异表达，PathFinder行功能富集，MultiMiR预测miRNA靶标，qPCR验证。患者样本来自University of Chicago（Dr. Joel Pekow提供；IRB 15573A、25-0294；Loyola University Chicago），包括17例活动期UC、21例非活动期UC和17例健康对照的结肠黏膜活检RNA。

研究结果：
3.1 乙醇加重结肠炎小鼠模型大肠IEC的mRNA测序（mRNA Sequencing of the Large IECs of a Mouse Model of Ethanol Exacerbation of Colitis）：通过DSS+乙醇小鼠大肠IEC的mRNA测序比较SV、DV和DE，发现DE vs. SV有3931个上调、3788个下调基因，DV vs. SV有4063个上调、3903个下调基因；共同富集JAK-STAT信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF-alpha信号通路、核小体组装、正调控超氧阴离子生成、蛋白磷酸化正调控和蛋白自磷酸化。DE vs. DV有921个上调、1072个下调基因，倍数富集最高的术语为GO-BP超氧阴离子生成（GO:0042554），HIF-1信号通路亦富集；SE vs. SV有979个上调、1038个下调基因，仅3个富集术语，故聚焦SV、DV和DE。结论是联合乙醇进一步扰动DSS相关基因表达，突出超氧阴离子和HIF-1通路。

3.2 mRNA测序所鉴定氧化应激通路基因的确认（Confirmation of Oxidative Stress Pathway Genes Identified in mRNA Sequencing）：通过qPCR验证，GO:0032930相关FPR2、ITGAM、ITGB2、TYROBP、CLEC7A中，除FPR2外，DE组均显著高于sham组和DV；GO:0042554相关NCF1、CYBB显著升高；HIF-1通路相关AKT3、CYBB、NOS2、HK3在DE中高于DV和sham，NOS2亦显著升高。结论是氧化应激相关基因表达变化被证实，NOX2（NADPH oxidase 2，NADPH氧化酶2）和NOS2参与超氧阴离子和一氧化氮（NO）产生。

3.3 miRNA测序与功能富集分析（miRNA Sequencing and Functional Enrichment Analysis）：通过miRNA测序及预测靶标富集，DV vs. SV有163个差异表达miRNA，富集细胞周期、DNA复制、DNA复制起始和GO:0032930；DE vs. SV有201个差异表达miRNA，富集DNA解旋、JAK-STAT、染色质、TNF信号通路、核小体组装和GO:0032930；DE vs. DV有84个差异表达miRNA，富集转录误调控、IL-17信号通路、破骨细胞分化、C型凝集素受体信号通路、炎症反应及GO:0042554，CYBB和NCF1为预测靶标；SE vs. SV有18个下调和27个上调miRNA，仅2个富集术语。结论是miRNA调控网络可能参与超氧阴离子生成。

3.4 患者样本中的靶标确认（Target Confirmation in Patient Samples）：通过患者结肠活检RNA检测，活动期UC的NOS2、CYBB、NCF1较非活动UC和健康对照显著升高（p<0.01）；因无电子病历（EMR）饮酒数据，分析其与CYP2E1（cytochrome P450 2E1，细胞色素P450 2E1）的相关性：NOS2正相关（Pearson R²=0.2101，Spearman r=0.3618，p<0.01），CYBB正相关（R²=0.1963，r=0.2798，p<0.05），NCF1正相关（R²=0.1995，r=0.5036，p<0.001），GAPDH组间一致。结论是这些基因在活动期UC升高并与乙醇代谢酶CYP2E1相关，但相关性较弱且不能替代饮酒数据。

讨论部分总结：UC本身增加结肠氧化应激，中性粒细胞是ROS和RNS的重要产生者；NOX2由CYBB、NCF1等亚基组成并产生超氧阴离子（O₂^?），NOS2/iNOS（inducible nitric oxide synthase，诱导型一氧化氮合酶）由L-精氨酸产生NO；NO可氧化为亚硝酸盐（NO₂^?）和硝酸盐（NO₃^?），O₂^?与NO可形成过氧亚硝酸盐（ONOO^?），氧化蛋白、脂质和核酸并导致凋亡和坏死。氧化应激可影响微生物组：结肠厌氧环境中Bacteroidetes和Firmicutes多为专性厌氧有益菌，Proteobacteria多为兼性厌氧病原菌，硝酸盐还原菌可利用硝酸盐，ROS/RNS增加可能促进菌群失调。酒精本身增加氧化应激：吸收后经乙醇脱氢酶（ADH，alcohol dehydrogenase）和乙醛脱氢酶（ALDH，aldehyde dehydrogenase）代谢，IEC的CYP2E1代谢乙醇产ROS，乙醛抑制抗氧化基因，乙醇上调NOS2并增加NO和过氧亚硝酸盐。局限包括无法获取患者EMR饮酒资料，CYP2E1相关性较弱且可能受其他因素影响；患者队列主要为白人，限制种族范围。研究结论（翻译）：这些结果提示，乙醇与DSS联合暴露可能增加活性氧的产生，从而进一步损伤肠黏膜，并可能促进乙醇加重结肠炎。