一种用于监测肺损伤中钙稳态失调的溶酶体靶向荧光探针

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A lysosome-targeted fluorescent probe for imaging calcium dysregulation in lung injury

　　

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  一种用于荧光成像溶酶体Ca²⁺水平的分子探针。
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  溶酶体内的酶促水解和Ca²⁺螯合触发绿色发射。
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  急性肺损伤和肺纤维化中溶酶体Ca²⁺水平升高。

引言

细胞内钙离子（Ca²⁺）是真核细胞信号转导中最普遍的-second messenger，通过高度精确的时空动态编码[4]，调控几乎所有核心细胞过程[1]，包括受精、细胞增殖与分化、细胞凋亡和自噬[2]、[3]。溶酶体是哺乳动物细胞中核心的酸性Ca²⁺储存细胞器。溶酶体腔内游离Ca²⁺浓度范围为500至600 μM，比胞质Ca²⁺水平高出四个数量级[5]、[6]，使溶酶体成为细胞Ca²⁺信号网络不可或缺的组成部分[7]。越来越多的证据表明，溶酶体Ca²⁺稳态失调是推动细胞功能障碍和炎症级联异常激活的核心事件，反映了多种致命疾病的发病与进展，包括肺部炎症、纤维化和恶性肿瘤[8]、[9]、[10]。在急性肺损伤（ALI）和慢性肺纤维化（PF）的病理进展中，溶酶体Ca²⁺稳态紊乱直接介导气道上皮细胞损伤、炎症小体异常激活和成纤维细胞病理性活化[11]。溶酶体Ca2?稳态已成为理解肺疾病病理生理机制和开发靶向治疗的尖端核心靶标[12]、[13]。

鉴于溶酶体Ca²⁺信号在调控细胞稳态中的关键生物学和病理学意义，用于特异性监测溶酶体Ca²⁺动态的成像工具对于解析病理生理功能至关重要[8]、[9]。然而，传统的Ca²⁺荧光探针通常缺乏溶酶体定位特异性，因此无法准确追踪溶酶体Ca²⁺信号动态[14]、[15]、[16]。溶酶体中固有的蛋白酶和极端的pH值（4.5–5.5）仍然是溶酶体靶向Ca²⁺探针的障碍[17]、[18]。在生物样本中对溶酶体Ca²⁺水平的成像仍然具有挑战性，从而阻碍了对潜在病理机制的深入理解[19]。

在此，我们报道了一种溶酶体靶向的Ca²⁺荧光探针MBPY，该探针采用吡若尼作为荧光团[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]，并利用2-(2′-吗啉-2′-氧基乙氧基)-N,N-双(羟基甲酰基甲基)苯胺作为潜在Ca²⁺螯合基团（LCG）[27]、[28]（图1）。在吡若尼单元的中位引入氨基赋予其多种共振结构，其中带氮的阳离子形式负责溶酶体靶向。LCG和吡若尼单元之间发生光诱导电子转移（PET），导致MBPY荧光消失。当被溶酶体摄取后，经过酶催化水解和Ca²⁺螯合，荧光得以恢复，且强度与Ca²⁺水平成正比。MBPY具有良好的生物相容性和稳定性，适用于测定生物样本中溶酶体Ca²⁺水平的变化。随后，我们首次实现了脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤和博来霉素（BLM）诱导的肺纤维化模型中溶酶体Ca²⁺稳态失调的可视化。

章节摘要

通用信息

本工作中使用的化学试剂均购自能瑞化学（上海，中国）。所有反应均在氩气（Ar）氛围下进行。吡若尼-9-硫酮（PS）按照文献[25]合成。柱色谱用的硅胶（200–300目）和薄层色谱（TLC）用的硅胶板（60F-254）购自青岛海洋化工有限公司（青岛，中国）。用于光谱测量的所有溶剂均为

MBPY对Ca²⁺的荧光响应

MBPY的吸收最大波长出现在约353 nm处（图S8），加入Ca²⁺后变化不大，但在酯酶催化水解后红移至约460 nm处（图2A）。MBPY的酯式对Ca²⁺表现出微弱的荧光响应（图S9）。然而，在酯酶催化水解酯基后，潜在钙螯合基团（LCG）转化为游离酸形式，在Ca²⁺存在下于545 nm处显示出强发射（图S9）。当加入1.0 mM Ca²⁺时

结论

在本工作中，我们合理设计并构建了MBPY，一种溶酶体靶向的开-关型Ca²⁺荧光探针。该探针显示出对Ca²⁺的高度特异性响应、精确的溶酶体靶向能力和良好的体内生物相容性，能够在生理和病理条件下实现溶酶体Ca²⁺动态的高保真可视化。借助MBPY的优秀性能，我们首次在

作者贡献声明

金静怡：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。王玲玲：撰写 – 审稿与编辑、形式化分析、数据整理。钟玲：验证、调查。康欣：撰写 – 初稿、验证、调查。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

本工作得到国家自然科学基金委（NSFC 22367022）的支持。王博士感谢中国博士后科学基金（20250535）的资助。

竞争利益声明

作者声明不存在已知可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

康欣|王玲玲|钟玲|金静怡