目标诱导的刚性四面体DNA自塌缩用于复杂介质中可编程高保真microRNA检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Target-induced Self-Collapsing of Rigid Tetrahedral DNA for Programmable High-Fidelity microRNA Detection in Complex Media

　　

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  靶向诱导tFNA自塌缩驱动级联信号放大
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  刚性四面体DNA框架实现抗干扰miRNA检测
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  传感网络可通过序列设计实现可编程和可调谐
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  该平台实现单碱基错配的高保真区分
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  该平台为可编程核酸检测提供通用框架

引言

微小RNA（miRNAs）是一类长约18-25个核苷酸的内源性非编码RNA，在基因表达调控中发挥关键作用，并参与细胞增殖、分化、凋亡及疾病进展等多种生物过程[1]。重要的是，循环miRNAs可稳定存在于血清和血浆等生物流体中，使其成为无创分子诊断的理想通用生物标志物[2]。然而，miRNA家族成员之间极小的尺寸、低丰度以及高度的序列相似性给其准确灵敏的检测带来了重大挑战。目前，miRNA分析主要采用基于扩增的方法，如逆转录定量PCR（RT-qPCR）和数字PCR，这些方法具有高通量和定量准确性的优势[3], [4]。然而，其局限性在实际临床应用中日渐凸显。首先，miRNA检测通常需要多步预处理程序，包括RNA提取、纯化和逆转录，这不仅增加了检测时间和操作误差，还提高了交叉污染和扩增偏倚的风险[3]。其次，复杂生理介质（如血清）中的前分析因素和基质相关抑制物会显著影响循环miRNA的分析。既往研究表明，miRNA定量对样本处理和RNA分离程序高度敏感，而生物基质中的抑制性成分可能干扰聚合酶反应或荧光读数，从而导致信号波动并降低分析可靠性[2], [4]。此外，循环miRNA的定量高度依赖样本处理方式，不同的提取策略可能导致测量水平出现数量级差异[5]。此外，基于PCR的方法需要精密的热循环仪和严格的温度控制，这限制了其在资源有限的环境和即时检测（POCT）场景中的应用[4], [6]。尽管等温扩增策略在一定程度上缓解了仪器依赖性，但其在复杂基质中的背景泄漏和非特异性扩增问题仍需进一步改善[7], [8], [9]。因此，开发一种能够在复杂生物环境中可靠运行并实现高特异性和灵敏信号输出的miRNA检测策略仍是一项关键挑战。

DNA纳米技术的快速发展为解决这些挑战提供了有前景的途径。凭借其高可编程性和可预测结构，DNA分子可通过Watson-Crick碱基配对被精确构建为多种纳米结构[10], [11]。其中，DNA四面体因其刚性的三维框架和明确定义的空间构型，在生物传感和分子递送领域引起了特别关注[12]。与线性DNA相比，四面体框架核酸（tFNAs）已被报道具有更优的核酸酶抗性和生物稳定性[13]，并能在电极或溶液界面支持定向和空间有序的探针排列，从而提高杂交效率和信噪比[14]。当进一步与核酸链置换或酶辅助扩增结合时，tFNAs能够在等温条件下实现高灵敏度的miRNA检测[15]。尽管具有这些优势，DNA纳米结构在复杂生理环境中仍可能发生降解[16]。此外，某些基于DNA的传感系统面临着背景泄漏和扩增效率方面的挑战[7], [8], [9]。动态DNA系统能够支持可编程反应网络和结构重构[17], [18]。对于基于四面体的miRNA传感而言，一个关键设计目标是实现靶标诱导的结构变化与酶促扩增的偶联，同时保持低背景水平。

在此，我们提出了一种结构程序化的DNA四面体生物传感平台，该平台能够实现对靶标的触发自塌缩和循环信号放大，用于高灵敏微小RNA检测。在此设计中，刚性DNA四面体不仅被构建为结构支架，还被设计为反应舱室，在空间上组织多个功能链。在靶标识别过程中，微小RNA与S2上的特定识别域结合，诱导tFNA的受控局部结构解锁，从而实现功能链的受控释放。这些释放的链随后经历程序化杂交和聚合酶辅助延伸，触发序贯链重分配过程并建立级联放大网络。该设计将单次分子识别事件转化为多阶段信号传播过程，从而实现高效靶标回收和持续信号放大。最终通过FAM/BHQ1荧光团-猝灭剂对的分离产生荧光，得到高度放大且低背景的光学信号输出。重要的是，该系统并未引入新的扩增化学，而是通过对结构受限反应网络的重新编程来重新定义信号扩增的启动和传播方式。通过将DNA四面体从被动支架转变为动态、自塌缩的信号处理纳米器件，该平台为在复杂生物介质中实现可靠的微小RNA检测提供了一种通用且可推广的方法。

章节摘要

材料与方法

本研究使用的DNA寡核苷酸（表S1）和dNTPs由上海 Sangon Biotech Co., Ltd. 合成。标记FAM或BHQ1的DNA链通过高效液相色谱（HPLC）纯化，而所有未修饰的DNA寡核苷酸则通过UltraPAGE纯化。所有DNA母液均溶解于1× TE缓冲液（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.6）中，并于使用前保存在4°C。Klenow片段DNA聚合酶（3'→5'外切酶缺陷型，KF）及其

靶标响应型tFNA传感器的设计与工作原理

如图1所示，开发了一种基于结构程序化DNA四面体的生物传感平台，用于靶标响应型微小RNA检测。在初始状态下，四条预设计的DNA链自组装形成致密的四面体框架，其中功能域被空间组织于刚性的三维结构中。当引入靶标后，微小RNA特异性结合S2上的识别域，诱导tFNA的局部自塌缩并

结论

综上所述，我们开发了一种结构程序化、靶标响应型的tFNA生物传感平台，用于高灵敏微小RNA检测。通过将刚性的三维DNA框架与靶标触发的级联自塌缩和聚合酶辅助扩增相结合，该系统通过结构化的反应网络实现了高效的信号产生。该平台表现出高灵敏度、优异的错配区分能力以及在复杂生物

CRediT作者贡献声明

Chang Xue（薛长）：写作—审阅与编辑，指导，项目管理，经费获取，概念构思。Guohui Xue（薛国辉）：写作—审阅与编辑，可视化，指导，项目管理，经费获取，概念构思。Guoqiang Chen（陈国强）：方法学，调查研究。Lin Hua（华林）：方法学，调查研究。Leyuan Wei（魏乐源）：可视化，方法学。Mengqi Zhan（詹梦琪）：方法学，调查研究。Yucheng Liu（刘宇诚）：方法学，调查研究，数据管理。Can Wang（王侃）：方法学，

利益冲突声明

作者声明，他们不存在可能影响本文报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢温州市科学技术局（项目编号：2023218）、江西省自然科学基金（项目编号：20242BAB25439和20252BAC220056）、温州医科大学实验室医学与生命科学学院重点实验室（项目编号：JS2023007）以及江西省卫生健康委员会科技计划项目（项目编号：202611083）的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在竞争性经济利益。

Jianxin Wu（吴建鑫）| Weixiang Liu（刘伟祥）| Yuanyi Wu（吴宇安）| Yucheng Liu（刘宇诚）| Can Wang（王侃）| Leyuan Wei（魏乐源）| Mengqi Zhan（詹梦琪）| Guoqiang Chen（陈国强）| Lin Hua（华林）| Chang Xue（薛长）| Guohui Xue（薛国辉）