整合免疫RPA与CRISPR/Cas12a的级联信号放大策略用于心肌梗死cTnI检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A cascade signal amplification strategy integrating immuno-RPA and CRISPR/Cas12a for cTnI detection in myocardial infarction

【字体：大中小】 时间：2026年10月25日 来源：Sensors and Actuators B: Chemical 7.7

编辑推荐：

　　摘要对肌钙蛋白I（cTnI）的准确、高灵敏检测对于心肌梗死（MI）的早期预警至关重要。我们开发了一种级联信号放大策略（CASAS），该策略整合了磁富集、条形码纳米探针、重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR/Cas12a，实现了对痕量cTnI的超灵敏和选择性定量。cTnI首

摘要

对肌钙蛋白I（cTnI）的准确、高灵敏检测对于心肌梗死（MI）的早期预警至关重要。我们开发了一种级联信号放大策略（CASAS），该策略整合了磁富集、条形码纳米探针、重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR/Cas12a，实现了对痕量cTnI的超灵敏和选择性定量。cTnI首先通过磁珠进行预富集，随后用条形码金纳米颗粒（barcode-AuNPs）标记，从而实现目标编码和初始信号放大。条形码DNA通过RPA进行指数扩增，生成的双链DNA产物触发CRISPR/Cas12a的横切活性，导致荧光素酶报告基因（FQ-reporters）持续降解并产生强荧光信号。双识别机制将免疫反应与DNA序列甄别相结合，有效减轻了复杂基质中的干扰，确保了优异的选择性。该检测方法具有从0.01至100 ng/mL的线性动态范围，检出限（LOD）为0.006 ng/mL。该平台表现出稳健的实用性能，回收率令人满意，并准确定量了心肌梗死小鼠模型的血清cTnI，与ELISA具有高度一致性。该方案仅包含两步等温孵育，无需酶标二抗或单独的DNA洗脱步骤，70分钟内即可完成，与传统ELISA相比，操作流程显著简化，周转时间更快。得益于级联信号放大策略，CASAS平台在灵敏度上较ELISA有了大幅提升。此外，借助其可编程性，CASAS可轻松适配为其他蛋白质生物标志物的通用检测平台。

引言

心肌梗死（MI）是由缺血和缺氧引发的严重心血管事件，可导致大面积不可逆的心肌坏死[1]、进行性心力衰竭[2]、[3]以及长期心血管并发症[4]。鉴于MI在心血管疾病中具有较高的死亡率，其对人类健康和寿命构成严重威胁，因此早期诊断对于改善患者预后至关重要。MI常用的诊断生物标志物包括肌红蛋白[5]、[6]、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）[7]、[8]以及心脏肌钙蛋白（cTnI和cTnT）[9]、[10]。然而，肌红蛋白缺乏组织特异性，而CK-MB在早期阶段的诊断准确性有限[11]。其中，cTnI因其仅存在于心肌细胞中、组织特异性高且在血清中升高持续时间长，与心肌损伤的程度和持续时间密切相关，已被确立为MI诊断的金标准生物标志物[12]。与健康个体基线水平（<0.4 ng/mL）相比，cTnI浓度超过2.0 ng/mL则提示急性心肌梗死的高概率[13]。传统cTnI检测技术，如酶联免疫吸附测定（ELISA）[14]、化学发光免疫分析[15]、[16]和胶体金免疫层析[17]、[18]，应用广泛，但存在若干局限性。这些局限性包括对早期MI中低丰度cTnI的灵敏度不足、检测时间较长可能导致诊断延迟、交叉反应导致的假阳性结果风险，以及对精密昂贵仪器的依赖[19]。因此，开发具有更高灵敏度的新型检测平台对于实现痕量cTnI的准确定量和支持及时的临床决策至关重要。

级联信号放大策略为解决上述局限提供了有效方案，满足了低丰度cTnI高灵敏检测的关键需求。免疫磁珠富集作为一种直接高效的初级放大步骤，能够从复杂生物基质中快速分离和浓缩目标cTnI[20]。在此基础上，Mirkin等人开创了一种以胶体金纳米颗粒（AuNPs）为载体、以合成DNA序列为编码标签的检测探针系统，可实现对目标蛋白分子的特异性标记[21]、[22]。AuNPs对抗体和DNA标签的高载量赋予其显著的纳米放大效应，从而大幅提升蛋白质生物标志物检测的灵敏度和特异性[23]。用于cTnI标记的DNA标签本身即为可扩增的核酸序列，结合强大的核酸扩增技术可实现次级级联放大，为痕量cTnI检测提供卓越灵敏度。重组酶聚合酶扩增（RPA）作为一种高效的等温扩增技术，可在37°C下于10–20分钟内达到可检测的目标DNA水平，从而大幅加速扩增过程[24]、[25]。近年来，CRISPR/Cas工具箱的诊断应用已从传统的核酸检测扩展至通过偶联功能适配体、邻近连接或抗体-DNA偶联物来检测多种非核酸目标物（如蛋白质、小分子和细胞外囊泡）。为进一步增强检测灵敏度和信号获取，本研究引入了CRISPR/Cas12a系统。当Cas12a与RPA扩增产物结合后，即表现出横切活性，持续降解FQ-reporter以产生三级放大信号输出[26]、[27]、[28]、[29]。序列特异性激活机制确保了高识别特异性，并赋予系统出色的可编程性。仅通过重新设计crRNA引导序列[30]，该系统即可轻松适配识别编码不同蛋白质目标的DNA标签，为灵活可靠的高通量多重检测铺平了道路。

因此，为满足心肌梗死（MI）早期快速诊断的需求，本研究旨在开发一种级联信号放大策略，用于在复杂生物基质中对低丰度cTnI进行高灵敏、高选择性的检测。所提出的方法系统性地整合了四个关键组成部分：免疫磁珠富集、纳米颗粒编码探针、RPA和CRISPR/Cas12a系统，整体工作流程如图1所示。具体而言，cTnI首先通过抗体功能化的磁珠从血清样品中选择性捕获和预富集。随后引入连接了检测抗体和单链DNA条形码的条形码-AuNPs以标记捕获的cTnI。该步骤既将蛋白质目标编码为DNA，又通过AuNP载体的高负载能力提供了初级信号放大。此后，释放出的单链DNA条形码经RPA进行快速等温扩增，生成的双链DNA扩增产物激活CRISPR/Cas12a，启动其附属横切活性并导致FQ-reporter的降解。该级联过程最终累积输出荧光信号，代表了次级、大幅度的信号放大阶段。与传统单步扩增相比，该级联系统具有两大关键优势。首先，其模块化设计通过生物识别实现各阶段的无缝衔接，构建高效反应级联，从而提升整体灵敏度。其次，初始抗体-抗原结合与后续核酸甄别相结合的双识别机制，有效减轻了复杂样本的基质干扰，确保了高保真度。由此，该平台在具有挑战性的生物背景中实现了对痕量cTnI的高灵敏、高特异定量，为MI早期诊断提供了有力工具。

章节片段

试剂与材料

cTnI蛋白及配套的单克隆抗体对——捕获抗体（Ab1，用于包被）和检测抗体（Ab2，用于标记）——购自上海凌博生物科技有限公司。该商品化抗体对靶向cTnI的两个不同且非重叠的表位，在三明治免疫分析中无空间位阻。肌酸激酶MB（CK-MB）、白介素12（IL-12）和BNP购自Sigma-Aldrich。cTnI ELISA试剂盒（QS43163）购自

表征

免疫捕获磁珠（MB-Ab1）通过将磁珠功能化连接cTnI抗体-1制备而成（图1A）。透射电子显微镜（TEM）形态学分析显示，裸磁珠单分散且粒径均匀（图1G-H）。元素映射证实碳（C）、氧（O）和铁（Fe）在磁珠表面均匀分布（图1K），而氮（N）和硫（S）信号几乎检测不到（图S2A和图S2B）。

结论

本研究提出了一种精密的级联信号放大框架，专用于cTnI的超灵敏和高特异检测。该方法包含四个关键要素：免疫捕获磁珠、纳米编码探针、RPA和CRISPR/Cas12a技术。与传统cTnI检测技术相比，该策略具有多项独特优势。首先，序列特异性识别与渐进式信号放大的融合确保了

CRediT作者贡献声明

苏建华：软件、调查。周大鹏：写作——初稿、方法论。陈小波：形式分析、数据整理。尹慎涵：概念构思。刘振平：指导。杨森：写作——审稿与编辑、资源。王先锋：项目管理、资金支持获取。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究受到国家自然科学基金（82502826）、江苏省青年自然科学基金（BK20221090）、江南大学与无锡市第二人民医院合作项目（新型MOTS-c肽通过L型氨基酸转运体1转运激活Nrf2/ARE通路改善年龄相关性肌少症的作用与机制研究）、广西自然科学基金（2025GXNSFBA069209）、资助。