CuFe2O4@SiO2负载锌(II)席夫碱配合物催化新型6-氨基-4-苄氧基苯基二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈的合成及体外细胞毒性评价

《Results in Chemistry》：Synthesis and in vitro cytotoxic evaluation of some new 6-amino-4-benzyloxyphenyldihydropyrano[2,3- c]pyrazole-5?carbonitriles catalyzed by zinc (II) complex supported on magnetite copper ferrite nanoparticles

　　

锌(II)配合物负载于磁性铜铁氧体纳米颗粒催化苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑的合成。制备6-氨基-苄氧基苯基-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈化合物作为新化合物。6-氨基-苄氧基苯基-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈化合物的抗癌研究。

研究背景与问题：吡喃并吡唑及其衍生物是药物工业中一类重要的生物活性化合物，可作为部分药物结构组成部分，具有抗菌、抗真菌、抗癌、抗炎等活性，并可作为人检查点激酶1（Chk1）的潜在抑制剂以及杀虫剂和可生物降解农用化学品。近期研究表明，含吡唑衍生物的抗癌药对癌细胞内的表皮生长因子受体（EGFR）、布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和BRAF V600E等靶点具有显著抑制作用；吡唑并吡唑衍生物对HOP92肺癌细胞系和KM12结肠癌细胞系显示抑制活性。其抗癌机制涉及作为三磷酸腺苷（ATP）竞争性激酶抑制剂、靶向细胞周期调控蛋白导致细胞周期阻滞、诱导凋亡以及干扰DNA修复过程。多组分一锅反应因省时、省溶剂、减少原料消耗、提高效率并减少废物而受到关注。四组分制备吡喃并[3,2-c]吡唑已有多种催化剂报道；将催化剂置于纳米磁性载体上因易分离、可重复使用、稳定性高和比表面积增大而受到重视。基于此，研究人员使用CuFe₂O₄@SiO₂/propyl-1-(o-vanillinaldimine][ZnCl₂]作为纳米磁性催化剂，在80 °C、无溶剂条件下制备新型苯基-1,4-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑，并鉴于该类化合物可能具有细胞毒性质，对部分新化合物在五种人癌细胞系及正常小鼠成纤维细胞L-929上进行体外评价。

主要技术方法：采用多组分一锅缩合合成，以CuFe₂O₄@SiO₂/propyl-1-(o-vanillinaldimine][ZnCl₂]为纳米磁性催化剂，薄层色谱（TLC）监测反应，红外光谱（IR）、¹H核磁共振（NMR）、¹³C NMR和质谱（MS）表征产物，并测定熔点；催化剂通过场发射扫描电子显微镜（FESEM）和Zeta电位表征。细胞毒评价采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）法，处理48 h，GraphPad Prism 8计算半数抑制浓度（IC₅₀）和选择性指数（SI），采用单因素方差分析（ANOVA）联合Dunnett检验。细胞系来源为：U-87、MCF-7、HeLa、HT-29、DU-145购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），L-929购自欧洲认证细胞培养物保藏中心（ECACC）。

研究结果：
4.1 合成：研究人员依据前期报道制备锌(II)席夫碱配合物负载于二氧化硅包覆铜铁氧体纳米颗粒；FESEM显示催化剂颗粒尺寸小于100 nm，纳米尺度提高比表面积并增加与原料接触，有利于反应进行。
4.2 鉴定：在25 °C、电极电压3.3 V下测定Zeta电位，催化剂颗粒平均Zeta电位为68.3 mV；高于60 mV时颗粒保持较小尺寸、聚集倾向低，活性表面理想并显示较高催化能力。
4.3 催化反应：以乙酰乙酸乙酯、苯甲醛、丙二腈和水合肼为模型反应优化条件，3 mg催化剂、80 °C、无溶剂条件下效果最佳，35 min时产率95%；乙醇、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷和N,N-二甲基甲酰胺回流条件下结果均不如无溶剂条件。不同含氯、硝基、甲氧基和羟基取代的芳香醛与乙酰乙酸乙酯、肼和丙二腈反应均高产率得到产物；进一步使用不同苄氧基取代芳香醛制备了新化合物；2,4-二硝基苯肼与含4-甲基苄氧基取代芳香醛、乙酰乙酸乙酯和丙二腈反应也以可接受结果得到相应产物。与已报道方法比较，本方法在产物产率和反应时间方面更合适。催化剂在模型反应后经热乙醇溶解、磁分离、丙酮洗涤干燥，成功重复使用3次。
4.4 反应机理：提出锌席夫碱配合物配位乙酰乙酸乙酯和肼，使二者顺式邻近并反应；肼亲核攻击乙酰乙酸乙酯羰基并脱水，随后胺基氮分子内攻击另一羰基并脱乙醇闭环，生成5-甲基-2,4-二氢-3H-吡唑-3-酮；丙二腈和醛连接锌并增加配位数，活化后脱水形成氰基烯烃中间体；烯醇式5-甲基-2,4-二氢-3H-吡唑-3-酮与该中间体反应，经闭环和互变异构得到最终产物。2,4-二硝基苯肼中N-2比N-1亲核性强，因其孤对电子未参与芳环共振，而乙酰乙酸乙酯酮羰基亲电性更强，故N-2与酮羰基作用、N-1与酯羰基作用。由于无手性催化剂，C-4位R/S中心形成条件相同，产物为外消旋且无光学活性。
4.5 体外细胞毒性：MTT法显示合成化合物AL-11至AL-61及阳性药顺铂和5-FU对U-87、MCF-7、HeLa、HT-29、DU-145及L-929的作用呈浓度依赖和细胞系特异性。U-87中除AL-41外，其余化合物及顺铂、5-FU在100 μM使细胞活力低于70%，AL-31活力37%、IC₅₀为87.22 μM，顺铂IC₅₀为41.33 μM；AL-11、AL-21、AL-31和AL-61较5-FU细胞毒活性更高。MCF-7中AL-21活力49%、IC₅₀为98.67 μM，顺铂活力34%、IC₅₀为67.45 μM；AL-11、AL-31和AL-51较5-FU细胞毒活性更高。HeLa中AL-11活力79%，与5-FU的80%相近，顺铂活力21%、IC₅₀为24.48 μM。HT-29中AL-11和AL-31活力分别为61%和60%，高于顺铂65%和5-FU69%的细胞毒活性；AL-21和AL-51与5-FU接近。DU-145中AL-31活力38%、IC₅₀为51.79 μM，顺铂IC₅₀为91.44 μM；AL-21、AL-31和AL-51较5-FU细胞毒活性更高。L-929正常细胞中所有化合物细胞活力均高于85%，AL-11、AL-21、AL-31、AL-41、AL-51、AL-61分别为87%、91%、89%、96%、96%、94%，而顺铂为42%、5-FU为73%，合成化合物对正常细胞毒性低于两种参考药。SI分析显示AL-21对MCF-7的SI大于1.0，AL-31对U-87的SI大于1.0、对DU-145约2.0。

讨论与结论译文：讨论表明，该纳米磁性催化剂粒径小、Zeta电位高、易磁分离并可重复使用，无溶剂80 °C多组分方法具有较高产率和较短反应时间；机理上锌配位活化促使乙酰乙酸乙酯、肼、丙二腈和醛发生串联反应；细胞毒评价中AL-21和AL-31表现出相对选择性的肿瘤细胞毒活性，且所有合成衍生物对L-929正常小鼠成纤维细胞保持高细胞活力。研究结论译文：在本工作中，研究人员使用CuFe₂O₄@SiO₂/propyl-1-(o-)vanillinaldimine [ZnCl₂]作为非均相且可重复使用催化剂，由乙酰乙酸乙酯、丙二腈、肼或2,4-二硝基苯肼与各种苄氧基芳香醛在80 °C、无溶剂条件下反应，制备了6-氨基-苄氧基苯基-二氢吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈化合物作为新化合物。合成和鉴定这些化合物后，研究人员采用MTT法评价了新合成衍生物（AL-11至AL-61）及参考药（顺铂和5-FU）对多种人癌细胞系（U-87、MCF-7、HeLa、HT-29和DU-145）以及L-929正常小鼠成纤维细胞系的体外细胞毒活性。总之，体外评价表明新合成衍生物（AL-11至AL-61）呈现浓度依赖性和细胞系特异性细胞毒性。系列中AL-21和AL-31是最有前景的候选化合物。具体而言，AL-21对MCF-7乳腺癌细胞显示显著活性，而AL-31对U-87胶质母细胞瘤和DU-145前列腺癌细胞显示强效活性，常优于参考药（5-FU和顺铂）。关键的是，所有合成衍生物在L-929正常小鼠成纤维细胞中维持高细胞活力（>90%），对正常细胞的毒性显著低于参考药。这些有利的安全性和选择性肿瘤细胞毒活性突出表明AL-21和AL-31可作为进一步抗癌药物开发的有价值先导化合物。