大白菜BrABA2基因3' UTR突变通过破坏表皮蜡质晶体引起光泽叶表型

《Plant Physiology and Biochemistry》：BrABA2 mutation conferred glossy leaf via epicuticular wax crystal disruption in Chinese cabbage

　　

在大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）中，研究人员鉴定了一个光泽叶突变体wdm19，该突变体由甲基磺酸乙酯（EMS）诱变产生。通过MutMap分析和竞争性等位基因特异性PCR（KASP）基因分型，确定BrABA2为候选基因。序列分析显示，wdm19的BrABA2 3'非翻译区（3' UTR）第304位存在G到A的单碱基替换，该替换显著降低了BrABA2的转录水平和蛋白积累。异源互补实验证实BrABA2突变导致表皮蜡质晶体减少，从而引起光泽叶表型。BrABA2是大白菜品种改良的新型遗传资源。

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）是东亚地区广泛种植的重要叶菜，其叶片光泽是近年来备受消费者青睐的外观品质性状。叶片光泽主要由表皮蜡质晶体（epicuticular wax crystal）的沉积状态决定，而蜡质的主要成分是超长链脂肪酸（very-long-chain fatty acids, VLCFAs）及其衍生物。尽管在大白菜中已鉴定出多个调控蜡质积累的基因（如BrWAX1、BrCER2、BrSHINE3等），但表皮蜡质形成的调控网络仍不完全清楚。已知植物激素脱落酸（abscisic acid, ABA）能够影响蜡质相关基因的表达，但ABA生物合成关键酶基因ABA2是否参与大白菜蜡质晶体形成此前尚无报道。因此，研究人员以叶面覆盖密集蜡质晶体的双单倍体系‘FT’为背景，从甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate, EMS）诱变群体中筛选到一个光泽叶突变体wdm19，旨在鉴定其致病基因并揭示其在表皮蜡质晶体形成中的作用。

研究人员通过遗传分析、图位克隆与功能验证，明确了wdm19的突变基因，并揭示了其调控叶光泽的分子机制。该研究不仅首次证明BrABA2参与大白菜蜡质生物合成，还为芸薹属蔬菜品质改良提供了新的基因资源。

在关键技术方法方面，研究人员以‘FT’和wdm19为材料，利用MutMap策略对‘FT’、wdm19及F2混合池进行全基因组重测序，结合竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR, KASP）对候选单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）进行共分离验证；采用冷冻扫描电子显微镜（Cryo-scanning electron microscopy, Cryo-SEM）观察叶表皮蜡质晶体，气相色谱-质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS）测定蜡质组分与含量；通过拟南芥aba2突变体（T-DNA插入突变体SAIL_1148_D08，购自ABRC）的异源互补和过表达验证基因功能；利用3'RACE克隆、逆转录定量PCR（Reverse Transcription quantitative PCR, RT-qPCR）和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时表达系统结合Western blot分析3'非翻译区（3' untranslated region, 3' UTR）突变对蛋白积累的影响。

研究结果如下：

3.1 Phenotypic trait of wdm19（wdm19的表型特征）：Cryo-SEM观察显示，‘FT’叶表面覆有密集蜡质晶体，而wdm19叶表面几乎无晶体，同时wdm19在整个发育阶段均呈现光泽叶表型，抽薹期差异最明显。

3.2 Decreased cuticular wax content and increased cuticle permeability in wdm19（wdm19角质层蜡质含量降低、通透性增加）：GC-MS测定表明，wdm19总蜡质负荷显著低于‘FT’，其中C₁₈、C₂₂、C₂₃、C₂₆、C₂₈和C₂₉组分均减少，尤其C₂₉降幅最大；同时，wdm19离体叶片水损失率和叶绿素浸出率均显著升高，说明蜡质减少导致角质层通透性增加。

3.3 Glossy leaf trait of wdm19 was controlled by a recessive nuclear gene（wdm19光泽叶性状受一个隐性核基因控制）：遗传分析显示，F1全部表现为灰绿叶，BC1（F1×wdm19）分离比符合1.13:1，F2群体分离比符合2.76:1，表明该性状由单基因隐性核基因控制。

3.4 MutMap analysis mapped the candidate genes（MutMap分析定位候选基因）：全基因组重测序和SNP-index分析将候选区间主要定位在A04和A08染色体，经外显子非同义突变过滤，在A08上得到3个候选SNP。

3.5 The candidate genes were screened out through KASP（通过KASP筛选候选基因）：第一轮KASP排除了3个候选SNP；第二轮在左侧区域重新选择3个SNP验证，只有位于BraA08g002170.3.5C基因上的SNP（A08:1,547,292）与光泽叶性状共分离，因此将该基因命名为BrABA2（其拟南芥同源基因为AtABA2/AT1G52340）。

3.6 Functional verification of BraA08g002170.3.5C via Arabidopsis transgenics（通过拟南芥转基因验证BraA08g002170.3.5C功能）：将Pro35S::BrABA2导入aba2突变体后，植株恢复灰绿叶表型，叶表面重新沉积丰富蜡质晶体；过表达BrABA2的Col-0与野生型一致；而aba2突变体表现为光泽叶、蜡质晶体稀少、水损失率和叶绿素浸出率显著升高。这表明BrABA2突变正是导致大白菜光泽叶表型的原因。

3.7 Sequence and phylogenetic analysis of BrABA2（BrABA2的序列与系统发育分析）：3' RACE和克隆测序发现，wdm19的BrABA2 3' UTR第304位发生G→A转换，而编码区序列与‘FT’一致，开放阅读框（open reading frame, ORF）为159个氨基酸；系统发育分析显示BrABA2在芸薹属中较为保守。

3.8 Expression pattern of BrABA2（BrABA2的表达模式）：RT-qPCR结果显示，wdm19根、茎、叶中BrABA2转录水平较‘FT’显著降低，表明3' UTR突变降低了基因表达。

3.9 Mutation in the 3' UTR reduced BrABA2 protein accumulation（3' UTR突变减少BrABA2蛋白积累）：在本氏烟草中瞬时表达携带不同3' UTR的FLAG-BrABA2构建体，Western blot显示含wdm19型3' UTR的BrABA2蛋白显著少于含‘FT’型3' UTR的，证明3' UTR突变影响了蛋白积累。

讨论与结论：该研究在EMS诱变群体中鉴定出光泽叶突变体wdm19，通过MutMap和KASP定位到BrABA2。3' UTR的单碱基替换降低了BrABA2的转录和蛋白水平，进而减少表皮蜡质晶体沉积，最终产生光泽叶表型。讨论指出，ABA通过调控蜡质相关转录因子（如MYB96等）促进蜡质生物合成，ABA2作为ABA合成关键酶，其突变可能通过削弱ABA信号而导致蜡质减少，但具体调控机制尚需进一步研究。此外，植物3' UTR在转录后调控中的重要性日益受到重视，本研究为3' UTR参与农艺性状调控提供了新证据。该研究为芸薹属蔬菜的分子育种提供了新靶点。

研究结论：在EMS诱导的wdm19突变体中，BrABA2 3' UTR区域的一个单碱基替换显著降低了其转录和蛋白水平；异源互补和过表达实验证实BrABA2调控大白菜叶片光泽。