《Plant Science》：EsPIP5K4, a target of Es-miR408, positively regulates salt tolerance in Siberian wildrye
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•Es-miR408通过其3′UTR负调控EsPIP5K4。•盐胁迫下调Es-miR408的表达，解除对EsPIP5K4的抑制。•EsPIP5K4正调控 Siberian wildrye的耐盐性。•Es-miR408–EsPIP5K4调控模块为牧草育种提供了遗传靶点。引言土壤
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Es-miR408通过其3′UTR负调控EsPIP5K4。
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盐胁迫下调Es-miR408的表达，解除对EsPIP5K4的抑制。
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EsPIP5K4正调控 Siberian wildrye的耐盐性。
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Es-miR408–EsPIP5K4调控模块为牧草育种提供了遗传靶点。
引言
土壤盐碱化是严重限制植物生长和全球农业生产力的主要环境因素之一（Islam et al., 2022, Gao et al., 2022a）。在中国，六个西部省份的盐碱地面积超过2510万公顷，占该国盐碱地总面积的近70%。Siberian wildrye（Elymus sibiricus L.）是该地区用于生态恢复和牧草生产的本土禾本科植物（De et al., 2021, Li et al., 2025）。然而，缺乏经功能鉴定的分子靶点，阻碍了其耐盐性的遗传改良。
植物进化出了复杂的调控网络以平衡生长与胁迫适应（Sun et al., 2023）。其中，miRNA是胁迫条件下关键的转录后调控因子（Patil et al., 2021），主要通过靶向切割mRNA或抑制翻译来发挥作用（Dong et al., 2022）。它们通过调控靶基因的表达来调节胁迫响应（Xing et al., 2022, Zhang et al., 2022, Qiao et al., 2023）。然而，Siberian wildrye中盐适应相关的miRNA介导的调控网络仍有待深入探索。
miR408是一种在进化上保守的miRNA，参与多种生物学过程，包括胁迫响应（Gao et al., 2022b）。它在不同植物物种中的耐盐作用存在差异。在拟南芥中，miR408过表达通过抑制编码含铜蛋白的基因来增强耐盐性（Ma et al., 2015）。在玉米中，miR408通过靶向ZmLAC9负调控耐盐性；miR408a/b的破坏或ZmLAC9的过表达促进木质素积累和细胞壁增厚，从而提高耐盐性（Qin et al., 2023）。在小麦中，miR408的靶基因TaCLP1参与对盐及其他非生物胁迫的响应（Feng et al., 2013）。这些发现表明，miR408的调控结果取决于其具体靶标，因此需要鉴定物种特异性的miR408靶标模块以实现定向育种。然而，miR408是否在Siberian wildrye中调控耐盐性，以及通过哪些靶标发挥作用，尚不明确。
通过对Siberian wildrye在盐胁迫下的miRNA-mRNA整合表达谱分析，EsPIP5K4被鉴定为Es-miR408的候选靶基因。EsPIP5K4编码一种磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶（PIP5K），催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）的生成，PIP2是一种参与气孔动态和胁迫相关钙信号传导的脂质信号分子（Heilmann, 2016, Zhang et al., 2020）。在拟南芥中，PIP5K基因受盐度诱导（Mikami et al., 1998），提示其可能参与盐适应。然而，EsPIP5K4是否在Siberian wildrye中贡献于耐盐性，以及其如何受Es-miR408调控，仍有待阐明。
在本研究中，我们调查了Siberian wildrye中Es-miR408与其候选靶基因EsPIP5K4之间的调控关系。我们利用整合的miRNA-mRNA表达谱分析和双荧光素酶报告基因实验，验证Es-miR408是否通过其3′UTR负调控EsPIP5K4。随后，我们采用TRV介导的病毒诱导基因沉默（VIGS）在Siberian wildrye中进行功能丧失分析，以及在大肠杆菌中进行异源过表达验证EsPIP5K4在耐盐性中的功能作用。通过这些方法，我们检验了作为Es-miR408靶标的EsPIP5K4是否贡献于盐适应，以及EsPIP5K4是否与盐胁迫下气孔性状的改变相关。本工作为理解Es-miR408–EsPIP5K4调控关系奠定了基础，并将EsPIP5K4鉴定为培育耐盐牧草的潜在遗传靶点。
部分摘要
材料、培养、盐处理与采样
Elymus sibiricus L.栽培品种'中草28号'由中国农业科学院草原研究所提供。幼苗培养及盐处理（250?mM NaCl）参照De et al.（2024）所述方法进行。为进行mRNA测序、小RNA测序及qPCR分析，在盐处理后0、2、4、6和12?小时收集叶片样品，立即液氮速冻，并保存于?80°C。
RNA提取、mRNA测序与数据分析
使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）从幼苗样品中提取总RNA
盐胁迫下EsPIP5K4作为Es-miR408候选靶基因的鉴定
为鉴定参与Siberian wildrye盐适应的miRNA靶标调控模块，我们在盐胁迫条件下进行了整合的miRNA-mRNA表达谱分析。从头组装共产生149,556个unigene，其中91,449个在公共数据库中成功注释（图S1；表S1）。来自15个文库的小RNA测序获得181,889,069条高质量reads，其中10,875个唯一标签被归类为已知miRNA，256个为新型miRNA（表S2–S3）。差异表达
Es-miR408–EsPIP5K4调控关系的鉴定与靶标验证
鉴定胁迫响应型miRNA的靶基因是理解其调控功能的关键步骤（Zhan et al., 2021）。多组相关性分析将Es-miR408和EsPIP5K4鉴定为一对候选miRNA-靶基因对。RT-qPCR确认了二者在盐胁迫下的表达存在强负相关，双荧光素酶报告基因实验（Liu and Axtell, 2015）进一步证明Es-miR408可抑制EsPIP5K4 3′UTR驱动的报告基因活性，表明
结论
总之，通过整合的miRNA–mRNA表达谱分析、RT-qPCR检测和双荧光素酶报告基因实验，我们在Siberian wildrye中鉴定了EsPIP5K4作为Es-miR408的靶基因。通过TRV介导的VIGS在Siberian wildrye中进行功能丧失验证以及在大肠杆菌中进行异源过表达的功能获得验证，证明EsPIP5K4可增强耐盐性。我们的数据进一步表明，EsPIP5K4通过促进脯氨酸积累以进行渗透
CRediT作者贡献声明
Zinian Wu（吴子年）：审稿与编辑、指导、项目管理、概念构思。Weihong Yan（颜维红）：数据整理。Dezhen Li（李德真）：撰写初稿、验证、方法论、调查研究、数据整理。Ying De（德莹）：审稿与编辑、撰写初稿、验证、指导、项目管理、调查研究、概念构思。Huaibin Mu（穆怀斌）：方法论。Fengqin Gao（高凤芹）：方法论。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在已知的竞争性经济利益关系或个人关系，这些关系可能影响本论文所报告的工作。
致谢
本研究得到国家重点研发计划（项目编号：2023YFD1200300）和国家自然科学基金（项目编号：31802121）的资助。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在已知的竞争性经济利益关系或个人关系，这些关系可能影响本论文所报告的工作。
德莹（Ying De）|李德真（Dezhen Li）|高凤芹（Fengqin Gao）|穆怀斌（Huaibin Mu）|颜维红（Weihong Yan）|吴子年（Zinian Wu）
