鸡胸腺单细胞RNA测序揭示模拟重组ALV垂直传播模型中的免疫抑制微环境

《Poultry Science》：Thymic single-cell RNA sequencing reveals the immunosuppressive microenvironment in chicken model simulating vertical transmission of recombinant ALV

禽白血病病毒（ALV）可诱导免疫抑制和肿瘤发生。本研究采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析无特定病原体（SPF）鸡胸腺免疫细胞的转录动态；这些鸡在胚胎内感染自然重组ALV-FJ15TH0，并于孵化后1日龄（1 d）、28 d和56 d取样。利用亚群特异性标记基因和细胞状态分析，研究鉴定出6个T细胞簇、2个B细胞簇和1个巨噬细胞簇。差异基因分析显示，ALV感染导致28 d时所有免疫细胞亚群中下调基因显著富集。功能富集分析表明，ALV感染激活了FoxO免疫抑制通路、PI3K通路、MAPK通路（1 d时CD4⁺CD8⁺ T细胞和M2巨噬细胞）、癌症通路的多细胞协同调控（28 d时CD4⁺CD8⁺ T细胞、M2巨噬细胞和细胞毒性T细胞）以及ErbB信号通路和Notch信号通路（56 d时CD4⁺CD8⁺ T细胞和M2巨噬细胞）。细胞间通讯分析显示，ALV感染在28 d诱导了经PPIA-BSG轴的最强预测通讯。分析进一步推断，CD147（BSG）与包括MAPK/ERK和PI3K/AKT在内的多条信号通路相关，可能促进免疫抑制微环境。BCL11B、SP3和EP300被鉴定为潜在调控组分，与JUN、BRAF和MYB具有亚群特异性关联，可能涉及MAPK、PI3K/AKT和FoxO信号通路。本研究揭示ALV-FJ15TH0感染后胸腺免疫微环境的动态演化，为理解ALV诱导免疫抑制的分子机制提供资源，并为未来研究其与肿瘤发生的潜在关系提供基础。

研究背景与问题：禽白血病病毒（ALV）是致癌性逆转录病毒，可导致鸡群肿瘤发生、生长迟缓和严重免疫抑制。胸腺是家禽T淋巴细胞分化成熟的中枢免疫器官，其微环境稳态对抗病毒细胞免疫建立至关重要。此前研究显示，自然重组ALV-FJ15TH0的gp85基因与ALV-B高度同源、LTR序列与ALV-J高度同源，胚胎内感染SPF鸡可致孵化后11周组织淋巴细胞增多并显示急性致癌性；ALV-FJ15TH0感染可显著激活鸡胸腺组织PPAR、JAK/STAT信号通路和脂肪酸降解通路，ALV-J感染可致外周血CD8⁺ T细胞比例异常并诱导免疫抑制。然而，ALV感染如何直接改变胸腺内T细胞数量、细胞异质性和分化轨迹尚缺乏系统认识。scRNA-seq已在人类和家禽免疫研究中应用，但尚未用于ALV感染鸡胸腺淋巴细胞免疫应答分析。因此，研究人员建立模拟ALV-FJ15TH0垂直感染的SPF鸡模型，采集孵化后1 d、28 d和56 d胸腺，开展scRNA-seq以解析胸腺免疫微环境。

研究开展与意义：研究人员用BGI C4 scRNA-seq表征感染组和对照组胸腺免疫细胞，发现ALV-FJ15TH0感染后胸腺免疫细胞群体变化高度可能关联免疫微环境和肿瘤相关过程。该研究提供理解ALV诱导胸腺免疫抑制微环境及候选分子机制的转录组资源，为禽逆转录病毒免疫逃逸机制及其与肿瘤发生潜在关系提供基础。

关键技术方法（不超过250字）：样本来自7日龄Leghorn SPF鸡受精蛋（Jinan Spafas Poultry Co., Ltd. China）60枚，随机分为两组各30枚；胚胎第7天经卵黄囊接种0.2 mL ALV-FJ15TH0分离株（2.3×10⁶ TCID₅₀，半数组织培养感染剂量）或等体积含1%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）；孵化后1 d、28 d、56 d每组随机3只，等量混合胸腺构建scRNA-seq文库。关键技术包括BGI C4 scRNA-seq（DNBelab C系列单细胞平台，MGI DNBSEQ-T7RS PE150测序）、实时定量PCR（qRT-PCR）验证、免疫荧光染色，以及Harmony整合、Seurat/统一流形近似与投影（UMAP）聚类、基于模型的单细胞转录组分析（MAST）差异分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）/基因集富集分析（GSEA）、Monocle3/Slingshot/Cyto-TRACE、Cell-Chat细胞通讯和转录因子调控网络分析。

研究结果：（1）ScRNA-seq identified 17 clusters。通过BGI C4 scRNA-seq和UMAP聚类，质量控制后获得41,019个有效细胞，鉴定17个细胞簇，注释出6个T细胞簇、2个B细胞簇、1个巨噬细胞簇、1个M2巨噬细胞簇、1个抗原提呈细胞簇和1个红细胞簇；CD4⁺CD8⁺ T细胞、SOX13⁺ T细胞、M2巨噬细胞、细胞毒性T细胞和红细胞亚群等被识别，免疫荧光证实胸腺皮质CD4⁺CD8⁺ T细胞较多、髓质有一定数量CD4⁺ T细胞。比例分析显示，1 d和28 d时ALV组CD4⁺CD8⁺ T细胞和细胞毒性T细胞比例较低、SOX13⁺ T细胞较高；56 d时CD4⁺CD8⁺ T细胞较高、SOX13⁺ T细胞较低；巨噬细胞比例在1 d较低、28 d和56 d较高。

（2）Changes in the Abundance of Immune Cells and Transcriptomic Profiles in the Thymus of Chickens Following Infection with ALV-FJ15TH0。通过差异表达分析，1 d、28 d和56 d各亚群均出现差异基因；28 d时四个亚群下调基因数均多于上调基因数，M2巨噬细胞差异基因数显著高于其他时点；SOX13⁺ T细胞在各时点上下调基因数最多；细胞毒性T细胞在1 d和28 d下调基因明显多于上调，56 d时SOX13⁺ T细胞和M2巨噬细胞下调基因明显多于上调。结果提示感染诱导胸腺免疫细胞丰度和转录组改变，可能参与免疫抑制及抗肿瘤免疫受损。

（3）Immunological changes in chicken thymic immune cells induced by ALV-FJ15TH0 infection。通过差异基因热图和UMAP分析，CD4⁺CD8⁺ T细胞中免疫抑制和肿瘤相关基因（SMAD3、SMAD2、CHUK、PTPN1、PTPN13、FOXO3等）在ALV组1 d、28 d、56 d较高；细胞毒性T细胞中促凋亡基因NINJ1较高，细胞周期抑制相关基因SMAD2、CDKN1A、代谢相关基因COX5A、COX6C、COX7C及抗病毒相关基因IFNRG1、IFNRG2较低；M2巨噬细胞中促肿瘤相关基因PIK3C2A、SAT1、EP300、CREBBP及促凋亡基因CDK5、SMAD2、CDKN1B较高；淋巴瘤相关癌基因BCL6在CD4⁺CD8⁺ T细胞和M2巨噬细胞1 d、28 d较低，FOXO通路关键基因在CD4⁺CD8⁺ T细胞28 d较高。结果揭示亚群特异性免疫抑制微环境相关基因改变。

（4）ALV-FJ15TH0 infection causes alterations in the function of immune cells in the chicken thymus。通过基因本体（GO）富集分析，CD4⁺CD8⁺ T细胞1 d主要富集于细胞组分（核质、膜包被细胞器）和分子功能（转录辅激活物结合），28 d细胞组分类富集基因总数达峰值，56 d特异性富集于线粒体呼吸链复合物和氧化磷酸化等生物学过程；SOX13⁺ T细胞1 d富集蛋白折叠相关条目且细胞组分类基因数最高，28 d和56 d蛋白折叠相关生物学过程减弱而核相关条目（染色质、染色体、细胞周期）持续富集；M2巨噬细胞1 d富集负调控过程和氧化磷酸化，28 d细胞组分富集增加并出现细胞代谢、细胞氮化合物代谢，56 d出现损伤DNA结合、胸腺发育；细胞毒性T细胞1 d富集细胞器和染色体组织，28 d核糖体和翻译相关条目显著富集，56 d细胞组分富集下降、生物学过程增加且多为代谢相关。结果提示感染后各亚群功能改变具有异质性。

（5）Enrichment of immune cell subsets in the chicken thymus。通过KEGG和GSEA分析，CD4⁺CD8⁺ T细胞持续富集免疫抑制通路，FoxO信号通路为三个时点均富集的唯一免疫抑制通路；1 d富集癌症相关通路（Transcriptional mis-regulation in cancer、Chronic myeloid leukemia、Small cell lung cancer），28 d和56 d富集细胞周期（Cell cycle、Cellular senescence）、免疫抑制（IL17 signaling pathway）及肿瘤相关信号通路（ErbB、Notch）。SOX13⁺ T细胞各时点富集蛋白再折叠和代谢相关通路，28 d代谢通路富集最大，并富集FoxO、mTOR信号通路。M2巨噬细胞在1 d、28 d、56 d富集癌症相关和免疫抑制通路，均富集FoxO，并富集PI3K、MAPK、Wnt等癌症相关通路，28 d还富集TGF-β、IL-17信号通路。细胞毒性T细胞三个时点富集代谢通路（氧化磷酸化、cAMP signaling pathway），1 d富集细胞周期通路，28 d和56 d主要富集癌症相关通路（Transcriptional misregulation in cancer、Viral carcinogenesis、PI3K、MAPK、Pathways in cancer、TGFβ）。结果说明各亚群富集模式不同，涉及致癌、细胞存活、免疫抑制和代谢。

（6）Degree of differentiation of chicken thymocyte subsets。通过Cyto-TRACE分析八类细胞，增殖T细胞、增殖T2细胞和SOX13⁺ T细胞评分较高，提示推断发育潜能较高、分化程度较低；CD4⁺CD8⁺ T细胞、细胞毒性T细胞和M2巨噬细胞评分较低，符合更分化状态。ALV组CD4⁺CD8⁺ T细胞和增殖T细胞评分无显著差异；T3细胞、增殖T2细胞、naive T细胞和细胞毒性T细胞评分显著降低，SOX13⁺ T细胞和M2巨噬细胞评分显著升高。结果提示感染与部分亚群推断发育潜能改变相关。

（7）Analysis of the developmental trajectories of T-cell subsets。通过Monocle3和Slingshot拟时序分析，Monocle3推断路径为naive T细胞至T3细胞，再分支至CD4⁺CD8⁺ T细胞和SOX13⁺谱系；Slingshot得到相似拓扑，naive T细胞产生T3细胞后分支至CD4⁺CD8⁺ T细胞和细胞毒性T细胞谱系；ALV组与NC组轨迹相似。

（8）Changes in Communication Among Thymic Immune Cells Following ALV-FJ15TH0 Infection。通过Cell-Chat分析，四类细胞（CD4⁺CD8⁺ T细胞、SOX13⁺ T细胞、细胞毒性T细胞和M2巨噬细胞）在ALV组1 d、28 d、56 d通讯更强，28 d达峰值；SEMA7基因集在1 d和56 d、CypA基因集在1 d和56 d于ALV组更强，APP基因集在ALV组28 d更强而NC组56 d更强；PPIA表达细胞数在三类免疫细胞中最高，且较多细胞共表达PPIA和BSG。配体-受体分析显示，1 d和28 d APP-TNFRSF21通讯概率较高，1 d SEM7A-PLXNC1较高，28 d和56 d PPIA-BSG较高，28 d时CD4⁺CD8⁺ T细胞和M2巨噬细胞的PPIA与细胞毒性T细胞BSG通讯概率较高，56 d时M2巨噬细胞PPIA与细胞毒性T细胞BSG通讯概率较高。结果提示感染增强胸腺免疫细胞通讯，28 d PPIA-BSG轴突出。

（9）Changes in the activity of transcription factors in thymic immune cells following infection with ALV-FJ15TH0。通过转录因子活性分析，BCL11B和SP3在ALV组1 d、28 d、56 d活性较高，56 d时EP300活性更高；SP3与靶基因FOS、BCL2相关，BCL11B与CCND1、ATP5PF相关，EP300与COX7C、PIK3R1相关，BCL11B、SP3和EP300均与JUN、BRAF、MYB、BTG1相关，SP3与EP300之间权重较大。结果预测该调控网络涉及MAPK、PI3K/AKT和FoxO等信号通路。

讨论部分总结：讨论指出胸腺是T细胞发育和抗肿瘤免疫关键器官；既往ALV-J研究显示外周血CD8⁺ T细胞增加、B细胞前体发育阻滞、CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（Tregs）增加等；本研究的胸腺亚群组成与鹅胸腺和黄羽鸡胸腺研究具有保守性，且与外周血反应存在组织特异性。28 d出现的“转录下调”与肿瘤免疫学早期免疫逃逸现象一致。GO和KEGG结果提示不同亚群功能反应异质，CD4⁺CD8⁺ T细胞和M2巨噬细胞优先激活癌症相关通路和FoxO免疫抑制通路，28 d富集ErbB、TGF-β、Wnt，56 d富集Notch，提示多细胞协同建立免疫抑制微环境。通讯增强及PPIA-BSG经CD147（BSG）可能激活MAPK/ERK、PI3K/AKT、STAT3和NF-κB等多通路信号网络，驱动胸腺免疫抑制微环境恶化并促进持续感染。BCL11B、SP3和EP300为预测转录调控组分，与JUN、BRAF、MYB等关联，涉及MAPK、PI3K/AKT和FoxO。讨论还提出这些发现可能为ALV防控、疫苗研究及抗病育种提供候选分子靶标或生物标志物。局限性包括：混合样本设计限制动物水平统计推断；仅分析胸腺，不能完全反映外周免疫区室；KEGG分析因基因同源可能返回人类疾病相关通路；肿瘤微环境、肿瘤起始、肿瘤进展及PPIA-BSG等机制主要基于计算预测，仍需功能验证。

研究结论翻译：综上所述，ALV-FJ15TH0垂直感染SPF鸡后，病毒通过激活胸腺免疫细胞亚群中的免疫抑制和肿瘤相关信号（FoxO通路、Notch通路、Wnt通路、PI3K通路、MAPK通路、ErbB通路等），通过多细胞亚群协同作用、PPIA-BSG免疫逃逸轴以及BCL11B-SP3-EP300预测转录网络，系统性重塑鸡胸腺免疫微环境。本研究为阐明ALV-FJ15TH0诱导免疫抑制和淋巴瘤发展的分子机制提供理论基础，并为抗病毒免疫治疗策略开发确定潜在靶点。