母源25-羟基维生素D3补充对后期产蛋种鸭繁殖性能、肝脏脂质代谢及子代影响的机制研究

《Poultry Science》：Effects of maternal 25-hydroxyvitamin D? supplementation on reproductive performance and hepatic lipid metabolism of late-laying duck breeders and offspring

　　

本研究评估了日粮中添加25-羟基维生素D3（25-OH-D3）对后期产蛋种鸭繁殖性能和脂质代谢的影响，以及对子代肝脏脂质代谢的影响。将40只64周龄、体重和产蛋性能相近的健康种鸭随机分为两组：对照组饲喂基础日粮，处理组在相同基础日粮中添加1000 IU/kg的25-OH-D3，试验持续15周。与对照组相比，25-OH-D3组的产蛋率、血浆和卵巢中的促卵泡激素（FSH）浓度以及卵巢雌二醇（E2）浓度均显著升高（P < 0.05）。25-OH-D3组的血浆、肝脏和蛋黄中的甘油三酯（TG）浓度以及肝脏总脂肪含量均高于对照组，而血浆总胆固醇（CHOL）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度以及肝脏LDL-C浓度则显著降低（P < 0.05）。肝脏转录组分析显示，差异表达基因主要富集于脂肪酸代谢和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）相关信号通路。与对照组相比，25-OH-D3组参与脂肪酸转运、合成、延伸、去饱和及活化的基因如FABP1、FABP3、FASN、ELOVL2、FADS1、FADS2和ACSBG2表达上调，而与脂蛋白处理和脂质转运相关的基因如APOA4、LCAT和CETP则表达下调。在胚胎发育第20天（E20），25-OH-D3组的子代胚胎肝重和肝脏指数显著高于对照组（P < 0.05）。在1日龄子代中，25-OH-D3组的血浆CHOL和HDL-C浓度以及肝脏HDL-C浓度均低于对照组（P < 0.05）。此外，子代肝脏RNA-seq结果显示，差异表达基因显著富集于PPAR信号和脂质相关通路，其中25-OH-D3组PCK1、ACSL5、NR4A1、NR4A2和NR4A3的表达低于对照组。总之，与对照组相比，25-OH-D3组的产蛋性能更高，同时母鸭血浆、肝脏和蛋黄中的TG浓度升高，循环CHOL和HDL-C浓度降低，这种变化也体现在其1日龄子代中。此外，25-OH-D3组子代在E20时的胚胎肝重和肝脏指数也高于对照组。

研究背景与科学问题

随着产蛋周期的延长，蛋禽面临巨大的能量利用和脂质周转压力。肝脏作为家禽体内脂质合成与转运的核心器官，负责产生大量富含脂质的前体物质以支持卵泡生长和蛋黄形成。然而，随着年龄增长，肝脏维持代谢平衡的能力会下降，容易导致肝脏过度脂质沉积，进而损害繁殖性能。维生素D₃及其衍生物除了经典的钙磷平衡调节功能外，近年来的证据表明其在调控脂质代谢方面也具有重要作用。其中，25-羟基维生素D₃（25-OH-D₃）作为血液中的主要代谢产物，其吸收效率和生物活性通常优于普通维生素D₃。已有研究发现，在产蛋后期的种鸭日粮中添加25-OH-D₃可改善产蛋性能并降低循环和肝脏中的胆固醇水平。然而，这种繁殖性能的提升是否伴随着母体肝脏脂质代谢和脂质分配的改变，以及母源性25-OH-D₃如何通过影响肝脏脂质加工和蛋黄脂质沉积进而调控子代的脂质稳态，这些问题尚未得到系统性阐明。因此，本研究旨在探讨日粮中添加25-OH-D₃对后期产蛋种鸭繁殖性能、肝脏脂质处理、蛋黄脂质沉积的影响，同时评估其对子代脂质稳态的影响。

研究方法与技术路线

研究人员选取40只64周龄、体重和产蛋性能相近的健康种鸭，随机分为对照组（基础日粮）和处理组（基础日粮添加1000 IU/kg 25-OH-D₃），每组设10个重复，每个重复2只鸭，试验期15周。研究采用了以下关键技术方法：1）采用索氏抽提法测定肝脏总脂肪含量，并使用生化试剂盒和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血浆、肝脏、蛋黄及卵巢组织中的脂质参数和生殖激素浓度；2）利用Illumina测序平台进行肝脏转录组测序，并通过edgeR筛选差异表达基因（DEGs），结合DAVID进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；3）运用基因集富集分析（GSEA）和加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定与表型相关的关键基因模块；4）通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证关键基因的表达水平；5）采用Mantel检验和Spearman相关性分析评估繁殖性能与脂质代谢性状之间的关联。

研究结果

1. 种鸭的繁殖响应

与对照组相比，25-OH-D₃组的产蛋率显著提高（从52.51%升至70.30%，P < 0.05），而蛋重、受精率、孵化率和雏鸭体重无显著差异。这表明25-OH-D₃能够有效提升后期产蛋种鸭的产蛋性能。

2. 种鸭血浆、肝脏和蛋黄的脂质参数

在血浆中，25-OH-D₃组的甘油三酯（TG）浓度显著升高，而总胆固醇（CHOL）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度均显著降低。在肝脏中，25-OH-D₃组的TG浓度和总脂肪含量显著增加，而LDL-C浓度显著下降。在蛋黄中，25-OH-D₃组的TG浓度显著升高，而CHOL浓度无显著变化。这些结果表明25-OH-D₃促进了肝脏TG合成和蛋黄TG沉积，同时降低了胆固醇相关指标。

3. 种鸭血浆和卵巢中的生殖激素含量

25-OH-D₃组的血浆促卵泡激素（FSH）浓度以及卵巢FSH和雌二醇（E₂）浓度均显著高于对照组，而黄体生成素（LH）浓度无显著差异。这提示25-OH-D₃可能通过促进FSH和E₂分泌来增强卵泡发育和排卵功能。

4. 繁殖与脂质代谢性状的相关性分析

Mantel分析显示，25-OH-D₃处理与血浆脂质参数、肝脏脂质性状和蛋黄TG组成之间存在显著关联。Spearman分析进一步表明，产蛋性能与血浆和肝脏中胆固醇相关指标呈负相关，而肝脏TG含量与蛋黄TG含量呈正相关。

5. 种鸭肝脏转录组分析

RNA-seq共鉴定出626个DEGs（367个上调，259个下调）。功能注释显示这些基因主要涉及脂肪酸从头合成、脂肪酸分解代谢、固醇生物合成、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号和过氧化物酶体功能。GSEA证实脂肪酸生物合成途径在25-OH-D₃组中正向富集，而PPAR信号和脂肪酸降解途径呈负向富集。具体而言，参与脂肪酸摄取、转运、活化和合成的基因如FABP1、FABP3、FASN、ELOVL2、FADS1、FADS2和ACSBG2表达上调，而参与脂蛋白代谢和胆固醇转运的基因如APOA4、LCAT和CETP表达下调。WGCNA进一步确认了这些基因模块与表型的关联，qRT-PCR验证了关键基因的表达趋势。

6. 胚胎发育第20天子代的形态和器官指数

在E20时，25-OH-D₃组子代的肝重和肝脏指数显著高于对照组，而蛋重、胚重、腿长、卵黄囊重等指标无显著差异。这说明母源性25-OH-D₃促进了胚胎肝脏的发育。

7. 1日龄子代的器官指数和脂质参数

1日龄子代的体重和各器官指数在组间无显著差异。但在血浆中，25-OH-D₃组子代的CHOL和HDL-C浓度显著降低；在肝脏中，HDL-C浓度也显著降低。这表明母源性25-OH-D₃影响了新生子代的胆固醇代谢。

8. 1日龄子代肝脏转录组分析

子代肝脏RNA-seq共鉴定出133个DEGs（94个下调，39个上调），主要富集于脂肪酸生物合成、谷胱甘肽代谢、α-亚麻酸代谢、过氧化物酶体、PPAR信号和脂肪细胞因子信号等通路。其中，与脂肪酸活化、TG合成、胆固醇代谢、糖异生和核受体调控相关的基因如PCK1、ACSL5、LPIN2、INSIG1、NR4A1、NR4A2和NR4A3在25-OH-D₃组中表达下调，提示子代肝脏的葡萄糖和脂质利用能力发生了适应性调整。

讨论与结论

讨论部分指出，25-OH-D₃提升产蛋率的机制可能与增强FSH和E₂分泌有关，从而促进卵泡募集和成熟。与哺乳动物模型中维生素D通常表现出的抗脂质沉积作用不同，本研究中种鸭肝脏脂质含量升高反映了繁殖期禽类肝脏旺盛的脂质合成功能，而非病理性的脂肪变性。转录组数据表明，25-OH-D₃通过上调脂肪酸结合蛋白、脂肪酸合酶和延长酶等基因的表达，促进肝脏对长链脂肪酸的摄取、合成和重构，同时通过下调载脂蛋白和胆固醇酯转移蛋白的表达，重塑脂蛋白代谢，最终导致血浆HDL-C和CHOL降低而TG升高。对于子代，母源性25-OH-D₃在胚胎期促进了肝脏生长，并在出壳后降低了循环胆固醇负荷，同时下调了肝脏中参与糖异生、脂肪酸活化和酮体生成的基因表达，表明子代肝脏的葡萄糖和脂质利用模式发生了转变。

研究结论：在产蛋后期种鸭日粮中添加25-OH-D₃可提高产蛋性能，提升生殖激素水平，增强肝脏脂肪酸合成与转运相关基因的表达，并增加蛋黄TG沉积。母源性25-OH-D₃还促进了E20胚胎的肝脏生长，并影响了1日龄子代的胆固醇相关代谢和肝脏基因表达，表现为血浆CHOL和HDL-C降低以及肝脏HDL-C减少。