《Immunology》：TIM-3 Functions as an Activator of NK Cells in GBM and Can Be Upregulated by Torin-1: Implications for Exogenous NK Cell Transplantation
编辑推荐：
胶质母细胞瘤（GBM）微环境中的功能失调会促进肿瘤细胞增殖，同时负面重编程自然杀伤（NK）细胞的免疫监视。基于研究人员先前发现GBM患者肿瘤浸润性NK细胞下调TIM-3且TIM-3缺失与细胞毒性潜力降低相关的结果，本研究进一步探究TIM-3作为功能性NK细胞活
胶质母细胞瘤（GBM）微环境中的功能失调会促进肿瘤细胞增殖，同时负面重编程自然杀伤（NK）细胞的免疫监视。基于研究人员先前发现GBM患者肿瘤浸润性NK细胞下调TIM-3且TIM-3缺失与细胞毒性潜力降低相关的结果，本研究进一步探究TIM-3作为功能性NK细胞活性标志物的作用。在此，研究人员证明mTOR药理学抑制剂Torin-1可上调NK细胞上的TIM-3表达，从而保留并富集这一功能胜任的细胞群体，同时抑制GBM代谢。利用患者数据、基因敲除模型及患者来源的原位异种移植模型，研究人员将TIM-3表征为一种有助于NK细胞激活并使效应功能在Torin-1治疗条件下得以维持的受体。这些发现对外源性NK细胞移植策略具有直接启示意义，表明在筛选和工程化用于过继转移至GBM的NK细胞产品时应考虑TIM-3的表达状态，并且Torin-1预处理可能增强移植NK细胞在肿瘤微环境内的功能胜任能力。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
胶质母细胞瘤（GBM）是成人最常见且最具侵袭性的原发性脑恶性肿瘤，其微环境中存在严重的免疫抑制，导致天然免疫效应细胞如自然杀伤（NK）细胞的功能失调。T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3（TIM-3）最初被描述为T细胞上的抑制性受体，但在NK细胞上的功能尚存争议。已有研究表明，GBM患者肿瘤浸润性NK细胞（tiNK）的TIM-3表达显著低于外周血NK细胞（cNK），且TIM-3表达下降与NK细胞细胞毒性潜力降低相关。然而，TIM-3在GBM中究竟如何调控NK细胞功能，尤其是其是否可作为NK细胞活化的正向调节因子，此前尚未得到系统性阐明。此外，mTOR信号通路在GBM中常处于过度活化状态，但mTOR抑制剂对NK细胞功能的影响及其与TIM-3的关系仍不清楚。因此，本研究旨在揭示TIM-3在GBM微环境中对NK细胞功能的调控作用，并探索联合Torin-1（一种双mTOR复合物抑制剂）与TIM-3阳性NK细胞的治疗策略。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过一系列体外和体内实验，系统阐明了TIM-3在GBM中对NK细胞的正向调控作用。主要发现包括：
- 1.
TIM-3在体外扩增的NK细胞和GBM患者外周血NK细胞上高表达，但在健康供者外周血和肿瘤浸润NK细胞上低表达，提示TIM-3是一种诱导性活化标志物。
- 2.
Galectin-9（Gal-9）在GBM43细胞上呈高表达，但抗TIM-3或抗Gal-9中和抗体均不影响NK细胞对GBM43的杀伤能力，表明TIM-3的功能可能不依赖于其配体结合。
- 3.
通过CRISPR/Cas9介导的TIM-3敲除（TIM-3 KO）实验证实，TIM-3缺失导致NK细胞增殖减弱、细胞毒性下降，并伴随ERK和p70 S6K磷酸化水平降低，提示TIM-3通过MAPK/ERK和mTORC1信号轴支持NK细胞效应功能。
- 4.
在多种代谢抑制剂中，只有Torin-1能够特异性上调NK细胞上的TIM-3表达，而单独抑制mTORC1（雷帕霉素）或mTORC2（JR-AB2-011）均不能产生类似效果，提示Torin-1对TIM-3的调控涉及mTOR非依赖性途径。
- 5.
在3D GBM球体模型中，Torin-1预处理后联合TIM-3阳性NK细胞可实现最快的肿瘤清除；而在原位异种移植小鼠模型中，Torin-1联合TIM-3阳性NK细胞组展现出最优的抗肿瘤效果和最高的生存率，而TIM-3敲除NK细胞联合Torin-1的治疗效果甚至差于Torin-1单药治疗。
三、关键技术与方法
本研究采用的主要技术方法包括：
- •
流式细胞术：检测NK细胞表面TIM-3及其他免疫受体表达，评估GBM细胞系上TIM-3配体的表达谱。
- •
CRISPR/Cas9基因编辑：通过核糖核蛋白（RNP）电穿孔法在原代人NK细胞中实现TIM-3敲除。
- •
乳酸脱氢酶（LDH）释放法和CFSE标记流式细胞术：定量评估NK细胞对GBM靶细胞的细胞毒性。
- •
Seahorse生物能量分析：测定Torin-1处理前后NK细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。
- •
3D肿瘤球体实时细胞毒性分析：利用mCherry荧光标记的GBM43球体在Incucyte系统中监测肿瘤溶解动力学。
- •
原位异种移植小鼠模型：在NRG免疫缺陷小鼠颅内植入GBM43-luciferase细胞，通过生物发光成像监测肿瘤生长并评估联合治疗效果。NK细胞来源于健康供者外周血。
- •
磷酸化ELISA：定量检测ERK、AKT和p70 S6K的磷酸化水平。
- •
单细胞RNA测序数据分析：利用CellSeekr平台分析公共数据库中GBM患者标本的scRNA-seq数据。
四、研究结果详解
2.1 Galectin-9在GBM细胞上高表达，但Galectin-9/TIM-3相互作用不影响NK细胞功能
研究人员发现，Gal-9在GBM43细胞上呈最高表达，主要分布于细胞内而非细胞表面。然而，使用抗TIM-3（克隆F38-2E2，阻断CEACAM-1和PtSer结合位点而非Gal-9位点）和抗Gal-9中和抗体均未能改变NK细胞对GBM43的细胞毒性，表明TIM-3对NK细胞功能的影响可能源于受体本身而非配体结合。
2.2 TIM-3敲除导致NK细胞增殖受损和细胞毒性降低
通过优化电穿孔条件（250V，4.0ms脉冲，1次脉冲，2mm比色皿），研究人员实现了约40%的TIM-3敲除效率。TIM-3敲除后的NK细胞表型未发生明显变化，但细胞毒性和增殖能力均有下降。磷酸化ELISA显示ERK和p70 S6K磷酸化水平降低，而AKT磷酸化基本保持不变，提示TIM-3选择性影响MAPK/ERK和mTORC1信号轴。
2.3 Torin-1处理与NK细胞上TIM-3上调相关
在测试的多种代谢抑制剂中，仅Torin-1能在低浓度下上调TIM-3表达，而雷帕霉素和JR-AB2-011则下调TIM-3。值得注意的是，雷帕霉素与JR-AB2-011联合使用也无法模拟Torin-1的效果，其他双mTOR抑制剂AZD8055和OSI-027同样无法诱导一致的TIM-3上调，提示Torin-1的作用机制涉及mTOR非依赖性途径。此外，Torin-1对TIM-3的上调效应在NK细胞上具有细胞类型特异性，在单核细胞和T细胞上未见类似现象。
2.4 Torin-1增强TIM-3阳性NK细胞对抗GBM的活性
在联合处理实验中，雷帕霉素显著降低了NK细胞的总体细胞毒性，而Torin-1和JR-AB2-011未产生统计学显著差异。重要的是，在Torin-1存在下，TIM-3敲除的NK细胞（RNP组）仍能保持IFN-γ产生和细胞毒性，而野生型NK细胞（EP组）在Torin-1抑制下表现出中度功能下降，表明TIM-3有助于NK细胞抵抗Torin-1介导的抑制。
2.5 体外扩增的TIM-3阳性NK细胞联合Torin-1对3D GBM球体有效
在3D球体模型中，“预处理”方案（先用Torin-1处理球体过夜，洗去药物后再加入NK细胞）实现了最快速的球体溶解，在约24小时即出现mCherry荧光的急剧下降。“共处理”方案（Torin-1与NK细胞同时加入）也显示出类似的趋势，但清除残留荧光所需时间更长。所有含NK细胞的治疗组均观察到初始荧光面积增加，推测可能是NK细胞浸润所致。
2.6 Torin-1在体内上调NK细胞TIM-3的同时抑制GBM
在原位异种移植模型中，Torin-1单药或Torin-1联合TIM-3阳性NK细胞（EP组）均表现出优于PBS对照和Torin-1联合TIM-3敲除NK细胞（RNP组）的抗肿瘤效果。Torin-1联合TIM-3阳性NK细胞组获得了最高的生存率。免疫荧光染色显示，接受TIM-3阳性NK细胞治疗的小鼠脑肿瘤中TIM-3和IFN-γ表达更高，而TIM-3敲除组的IFN-γ和TIM-3水平较低，提示NK细胞浸润减少。
五、讨论与结论
本研究的核心发现是TIM-3在GBM微环境中充当NK细胞的激活因子而非抑制性受体。TIM-3缺失导致NK细胞功能受损，而Torin-1可通过mTOR非依赖性途径特异性上调NK细胞上的TIM-3表达，使NK细胞在代谢抑制环境下维持效应功能。这一发现挑战了TIM-3作为单纯抑制性受体的传统认知，将其重新定义为一种可在特定条件下发挥激活作用的免疫调节分子。
研究结论明确指出：TIM-3表达状态应作为筛选和工程化用于GBM过继性NK细胞移植产品的考量因素；Torin-1预处理可能增强移植NK细胞在肿瘤微环境内的功能胜任能力。Torin-1联合TIM-3阳性NK细胞的组合疗法有望成为GBM免疫治疗的新策略，其中Torin-1通过抑制GBM增殖发挥抑癌作用，而TIM-3阳性NK细胞则提供强大的细胞毒性效应。尽管TIM-3调控NK细胞代谢的具体机制仍有待深入探究，但本研究为开发基于NK细胞的GBM免疫治疗提供了重要的理论基础和转化前景。
