中国黄羽鹌鹑产蛋后期产蛋率差异的卵巢转录组与血清代谢组整合分析：关键基因、代谢物及通路鉴定

《Poultry Science》：Metabolomic and transcriptomic analyses reveal key genes and pathways associated with egg-laying rate in the late laying phase of Chinese yellow-feathered quails

蛋产量是蛋禽生产力的核心指标，产蛋后期产蛋量下降严重损害养殖经济效益。尽管在经历后期产蛋下降的群体中部分鹌鹑仍保持高产蛋量，但产蛋性能分化背后的分子机制尚不清楚。本研究对产蛋性能对比明显的产蛋后期中国黄羽鹌鹑进行卵巢转录组和血清代谢组整合分析。转录组学鉴定出751个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs；205个上调、546个下调），富集于类固醇激素生物合成、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR）信号通路、视黄醇代谢和神经活性配体-受体相互作用。蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interaction, PPI）网络分析进一步筛选出8个在低产组中上调的候选核心基因，包括F2、FGA、AHSG、SERPINC1、APOH、FGG、FGB和AMBP。代谢组学检测到141个差异表达代谢物（differentially expressed metabolites, DEMs；87个上调、54个下调），主要富集于胆汁酸生物合成、类固醇生物合成和ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白通路。多组学整合揭示这些关键基因与DEMs之间存在强相关；牛磺鹅去氧胆酸（taurochenodeoxycholic acid, TCDCA）与上述基因呈负相关。整合分析提示，胆汁酸和脂质代谢的变化可能与卵巢凝血相关过程和损伤反应相关，共同导致产蛋后期鹌鹑产蛋性能差异。该研究鉴定的候选基因和代谢物为进一步研究该时期卵巢功能变化提供线索，并可能为未来高产个体选择和营养干预研究提供参考。

产蛋后期产蛋性能下降是蛋禽养殖经济效益受损的重要原因。中国黄羽鹌鹑性成熟早、繁殖周期短、产蛋量高，但集约化饲养下生产周期约12个月，产蛋后期伴随卵巢衰老、卵泡数量与质量下降以及产蛋量降低。卵巢是决定蛋禽产蛋量的核心器官，氧化损伤、脂质代谢紊乱和卵巢衰老被认为是影响产蛋量与产蛋周期的重要因素；肝脏脂质代谢及卵黄前体供应也影响卵泡发育。然而，同一日龄产蛋后期高产与低产中国黄羽鹌鹑之间产蛋性能差异的分子机制尚不清楚。基于此，研究人员开展卵巢转录组与血清代谢组整合分析，以解析产蛋后期产蛋性能分化的分子基础，并为延长产蛋周期、高产个体选育及营养干预提供理论依据。

研究人员以100只11月龄健康中国黄羽鹌鹑为样本队列，按14 d平均产蛋率≥80%和<80%分别定义为产蛋后期高产组（OLH）和低产组（OLL），每组随机30只继续饲养2周，每组6只采样。研究整合生产性能与蛋品质测定、卵巢和肝脏组织学观察、血清与卵巢抗氧化及脂质代谢指标检测、卵巢转录组测序、血清非靶向代谢组分析以及转录组-代谢组关联分析。结果鉴定出751个DEGs和141个DEMs，筛选出8个在低产组上调的候选核心基因，发现TCDCA与上述基因负相关。整合分析提示，胆汁酸和脂质代谢变化可能与卵巢凝血相关过程及损伤反应相关，共同参与产蛋后期产蛋性能差异。该研究为筛选产蛋后期高产相关分子标记、开展高产个体选育和营养干预提供了候选线索。

关键技术方法：以11月龄中国黄羽鹌鹑为样本队列，参照Manwar等的高产日本鹌鹑判定阈值，按14 d平均产蛋率≥80%与<80%分为OLH和OLL，每组30只（3重复×10只）继续饲养2周，每组6只采集血液、卵巢和肝脏。检测生产性能与蛋品质；采用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色观察卵巢和肝脏组织学；测定血清与卵巢超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）及血清和肝脏甘油三酯（triglyceride, TG）、总胆固醇（total cholesterol, T-CHO）；进行卵巢RNA-seq（Illumina平台，DESeq筛选DEGs，GO/KEGG、PPI、基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），qRT-PCR验证）；进行血清非靶向代谢组（UPLC-MS/MS，PCA/OPLS-DA，KEGG）；开展DEGs-DEMs Pearson相关及共表达网络整合分析。

研究结果：
（1）生产性能与蛋品质测定：通过7 d和14 d生产性能记录发现，OLH产蛋率显著高于OLL、料蛋比显著低于OLL；14 d破蛋率OLH显著低于OLL，平均蛋重无显著差异；14 d卵巢指数OLH显著高于OLL。蛋品质测定显示14 d蛋壳厚度OLH显著高于OLL，其余指标无显著差异。
（2）卵巢发育与生化指标变化：通过卵巢大体观察和HE染色发现，OLH黄卵泡较大、卵泡结构较完整且颗粒细胞层排列紧密连续；OLL部分卵泡细胞排列松散、局部细胞结构紊乱、颗粒细胞层完整性受损。生化检测显示OLH卵巢和血清CAT、SOD、GSH-Px总体较高，而OLL卵巢和血清MDA较高。
（3）肝脏形态特征与脂质代谢：HE染色显示OLH肝细胞排列整齐、肝索清晰、细胞形态完整；OLL肝细胞排列紊乱并伴局部胞质脂滴沉积。检测显示血清TG无显著差异，OLL血清T-CHO和肝脏TG显著升高，肝脏T-CHO无显著差异。
（4）样本质量控制：卵巢转录组测序质控后两组分别获得125 115 122和141 685 264条clean reads，平均Q30达96.75%，平均GC含量48.26%，有效reads比对率均高于89.21%，测序数据质量合格。
（5）差异表达基因及富集分析：筛选出751个DEGs（205个上调、546个下调），聚类分析显示组间分离明显、组内重复性好。GO富集涉及外源物代谢、蛋白降解、糖异生、急性期反应和补体激活等；KEGG富集主要包括类固醇激素生物合成、PPAR信号通路、视黄醇代谢和神经活性配体-受体相互作用，其中后者富集DEGs数量最多。
（6）蛋白质-蛋白质相互作用网络分析：构建138个基因、229个互作对的PPI网络，采用Degree、MNC和EPC算法筛选出F2、FGA、AHSG、SERPINC1、APOH、FGG、FGB和AMBP 8个枢纽基因，均在低产组上调；MCODE插件获得评分最高的3个模块。
（7）基因集富集分析：GSEA显示OLH富集细胞骨架、黏着斑和核糖体相关通路；OLL富集过氧化物酶体、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢通路，PPAR信号通路呈富集趋势但FDR未达显著标准。
（8）实时荧光定量PCR验证：以GAPDH为内参，对F2、FGA、FGG、FGB、AHSG、AMBP、APOH和SERPINC1进行qRT-PCR，结果显示其表达模式与RNA-seq结果总体一致。
（9）血清代谢组学分析：鉴定出141个DEMs（87个上调、54个下调），代谢谱组间分离明显；富集通路主要包括ABC转运蛋白、嘧啶代谢、初级胆汁酸生物合成、类固醇生物合成、类固醇激素生物合成等。K-means聚类获得9个簇，簇3在OLL上调且主要涉及脂质和类固醇激素相关代谢物，簇1、7和9在OLH中较高且涉及脂质代谢、抗氧化和胆汁酸相关代谢物。
（10）转录组与代谢组整合分析：Pearson相关分析显示8个枢纽DEGs与多种DEMs显著相关；TCDCA与F2、FGA、FGB、FGG、SERPINC1、AMBP、AHSG和APOH呈负相关。共表达网络映射7个基因和10个代谢物，AMBP、FGB和F2连接度较高，网络内多数关联为负相关，提示脂质、胆汁酸和能量代谢变化参与卵巢功能调控。

讨论部分总结：讨论指出，低产组卵巢指数降低、颗粒细胞层完整性受损，同时卵巢和血清抗氧化酶活性降低、MDA升高，提示抗氧化防御减弱并伴脂质过氧化增强；低产组血清T-CHO和肝脏TG升高，提示肝脏脂质代谢异常。差异基因富集于类固醇激素生物合成、PPAR信号、视黄醇代谢和神经活性配体-受体相互作用，8个核心基因在低产组上调并经qRT-PCR验证；血清TCDCA降低且与上述基因负相关。原文讨论认为，胆汁酸和脂质代谢变化可能与卵巢凝血相关过程、代谢调节和损伤反应相关；TCDCA及相关候选枢纽基因是后续功能验证重点，血清代谢物不能直接代表卵巢局部代谢水平，后续需扩大样本、检测卵巢局部代谢物并开展TCDCA干预试验。

研究结论（译文）：本研究通过卵巢转录组和血清代谢组整合分析揭示，产蛋后期高产与低产鹌鹑之间的差异涉及脂质和胆汁酸代谢、凝血相关过程及损伤反应。结合卵巢指数、组织形态和抗氧化指标变化，研究人员推测代谢调节改变和氧化损伤可能共同参与低产表型的形成。TCDCA及其8个相关卵巢候选核心基因为进一步解析全身代谢状态与卵巢功能之间的联系提供线索，其具体作用仍需通过扩大样本量和功能试验验证。这些发现为筛选产蛋后期鹌鹑高产性能相关分子标记提供候选，也为后续高产个体选育和维持产蛋性能的营养干预研究提供参考。