《Poultry Science》：An integrated in vitro gastrointestinal digestion and fermentation model as a complementary tool for evaluating feed ingredients in young broilers: a case study with peas
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在肉鸡营养中寻找可持续蛋白质来源，提高了人们对本地生产原料（如豌豆）的兴趣。然而，替代性饲料原料的营养评估依赖于成本高昂且受伦理约束的动物试验，而缺乏能够代表幼龄肉鸡完整胃肠道的标准化体外模型。此类模型应反映幼龄肉鸡较低的消化能力和较简单的盲肠微生物群。本
在肉鸡营养中寻找可持续蛋白质来源，提高了人们对本地生产原料（如豌豆）的兴趣。然而，替代性饲料原料的营养评估依赖于成本高昂且受伦理约束的动物试验，而缺乏能够代表幼龄肉鸡完整胃肠道的标准化体外模型。此类模型应反映幼龄肉鸡较低的消化能力和较简单的盲肠微生物群。本研究开发了一种模拟幼龄肉鸡完整胃肠道的创新体外模型，并以豌豆作为案例研究，评估其对豆粕的部分替代效果，同时比较体外与体内反应。研究人员配制了等能量和等氮日粮，豌豆添加比例分别为0%、10%、20%和30%。体内试验采用10日龄肉鸡，评估生长性能、蛋白质消化率、肠道形态、盲肠发酵代谢产物及微生物群。与此同时，将相同日粮置于体外模型中，包括胃和小肠消化以及使用肉鸡盲肠接种物的发酵。豌豆添加比例的增加降低了生长性能和蛋白质消化率，并与回肠绒毛高度降低相关，表明在生豌豆添加量较高时营养利用降低。体内盲肠短链脂肪酸和氨浓度未受到显著影响，尽管氨呈数值下降趋势。体外条件下，含20%或30%豌豆的日粮表现出显著不同的消化动力学。在体外发酵过程中，豌豆的添加增加了产气量以及乙酸和丁酸的产生，同时降低了氨产生量，表明发酵更倾向于糖分解代谢。虽然体外结果与体内蛋白质消化结果一致，但体外盲肠发酵反应更为明显。这些研究结果表明，生豌豆可以部分替代幼龄肉鸡日粮中的豆粕，且体外与体内互补方法可将受控评估与动物生理学确认相结合。该模型在靶向体内评估之前提供了受控评估，但未来研究应通过评估接种物代表性和用于发酵的可溶性及细颗粒食糜组分的选择，来提高其对盲肠发酵的预测能力。
## 论文解读
### 1. 研究背景与问题
豆粕（soybean meal, SBM）是肉鸡日粮中最主要的蛋白质来源之一，但其生产存在环境问题，尤其是在不生产大豆的地区。因此，寻找可持续的本地替代蛋白源成为肉鸡营养研究的重要方向，豌豆因其蛋白质含量和本地可获得性受到关注。然而，替代性饲料原料的营养价值必须经过严格评估，尤其是对幼龄肉鸡而言，其胃肠道（gastrointestinal tract, GIT）仍处于发育阶段，消化酶分泌和营养吸收能力尚未成熟。目前，饲料原料和添加剂对肠道健康影响的评估主要依赖体内试验，这类试验虽然能提供动物生长性能、养分消化率和肠道反应的直接信息，但成本高、耗时长，并且涉及动物使用的伦理问题。体外胃肠道模型作为一种补充手段，能够在体内评估之前对饲料原料进行快速、受控的筛选。然而，现有的体外模型多集中于某个特定消化区室或终点消化率的测定，缺乏能够完整模拟肉鸡胃肠道——包括胃消化、小肠消化和盲肠发酵——的标准化模型，更鲜有专门针对幼龄肉鸡生理特点设计的模型。幼龄肉鸡（尤其是出壳后第一周至两周）的消化道处于快速发育期，消化酶分泌逐渐增加，盲肠微生物群也正处于定植和演替阶段，因此适用于大龄肉鸡的原料不一定适用于幼龄肉鸡。基于上述背景，本研究的目的是：（1）开发并验证一种模拟幼龄肉鸡完整胃肠道（从前胃到盲肠）的标准化体外模型；（2）以豌豆为案例原料，将该模型与体内试验同时用于评估生豌豆部分替代豆粕在幼龄肉鸡日粮中的可行性，并比较体外与体内反应的一致性。
### 2. 研究内容与总体结论
研究人员配制了等代谢能、等氮的四种试验日粮，豌豆添加比例分别为0%（对照组，以豆粕为主要蛋白源）、10%、20%和30%，部分替代豆粕。体内试验采用240只1日龄Ross 308公鸡，随机分为4个处理组，每组6个重复栏，每栏10只，试验期为10天。在试验结束时评估生长性能（平均日增重、平均日采食量、饲料转化率）、回肠粗蛋白表观消化率（apparent ileal digestibility, AID）、十二指肠组织形态学指标（绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度比值）、盲肠内容物的短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFA）、支链脂肪酸（branched-chain fatty acids, BCFA）、氨浓度及微生物群组成。与此同时，相同的四种日粮被应用于所开发的体外模型。体外模型包括三个主要阶段：（1）模拟上消化道（胃和小肠）的静态消化，其中胃阶段使用胃蛋白酶在pH 3下孵育90分钟，小肠阶段使用含有淀粉酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的胰酶溶液，酶活依据幼龄肉鸡体内的文献数据调整，并在不同时间点取样以分析蛋白质水解动力学；（2）使用3.5 kDa透析膜模拟小肠吸收，去除可被吸收的低分子量消化产物和胆汁成分；（3）使用来自2周龄Ross 308肉鸡盲肠内容物的接种物（1:9 w/v悬浮于厌氧磷酸盐缓冲液中）进行体外批次发酵，持续48小时，动态监测产气量、SCFA、BCFA、氨和微生物群变化。
研究总体结论为：生豌豆可在有限范围内部分替代幼龄肉鸡日粮中的豆粕；豌豆添加比例的升高（尤其是30%添加量）显著降低了肉鸡的体重增长，并使回肠绒毛高度显著下降，提示生豌豆在消化系统尚未发育完全的幼龄期会损害营养利用。盲肠发酵代谢物在体内未出现显著变化，但体外发酵结果显示豌豆添加使产气量、乙酸和丁酸生成显著升高，并降低了氨的生成，表明发酵模式向糖分解方向转变。体外模型在蛋白质消化方面与体内结果显示了较好的一致性，但在盲肠发酵反应上体外表现比体内更显著。该模型作为体内试验之前的受控筛选工具以及补充机制研究手段具有应用潜力，但其对盲肠发酵的预测能力仍需通过优化接种物和选择合适食糜组分加以改进。
### 3. 关键研究方法
研究所用的主要方法包括：**体内动物试验**：240只1日龄Ross 308公鸡随机分配到4种等能等氮粉状日粮（含豌豆0%、10%、20%、30%），为期10天，试验得到大学伦理委员会批准（项目编号L006/2024），饲料配制在比利时法兰德斯农业与渔业研究所（ILVO, Melle）完成；测定10日龄肉鸡的生长性能、回肠粗蛋白表观消化率（以二氧化硅为不可消化标记物，Dumas法测氮）、回肠组织形态学（苏木精-伊红切片和Alcian Blue-过碘酸雪夫染色）、盲肠SCFA和BCFA浓度（气相色谱法）、盲肠氨浓度（紫外酶法）、盲肠微生物群（16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序，QIIME2与R分析）。**体外上消化道模拟**：采用静态消化模型，模拟胃阶段（胃蛋白酶375 U/mL食糜，pH 3，41°C，90分钟）和小肠阶段（100 U/mL淀粉酶、50 U/mL胰蛋白酶、12.5 U/mL胰凝乳蛋白酶、10 mM胆汁盐，pH 7，41°C，0–120分钟动态取样），用邻苯二甲醛（o-phthaldialdehyde, OPA）法测定蛋白水解程度，并使用分数转换模型拟合动力学参数（k和Cf）。**体外吸收模拟**：使用3.5 kDa透析膜去除消化产物中可吸收组分，冻干获得未消化残渣。**体外盲肠发酵模拟**：以2周龄Ross 308肉鸡（先前试验、小麦-豆粕基础饲粮）的盲肠内容物为接种物，进行48小时批次发酵，使用Groot模型拟合产气动力学，测定不同时间点的SCFA、氨和微生物群。**统计与建模**：采用联合置信区间比较消化动力学差异，用PERMANOVA和LEfSe分析微生物群差异。
### 4. 研究结果
**豌豆对回肠粗蛋白表观消化率和生长性能的影响**：在10天试验期间，各处理组的采食量无显著差异。与对照组相比，30%豌豆组肉鸡的10日龄体重和总增重显著降低（P<0.05），但各处理组间的饲料转化率无显著差异。回肠粗蛋白表观消化率随豌豆添加量增加呈持续下降趋势，但差异未达显著水平。
**豌豆改变回肠组织形态学**：绒毛高度从对照组向30%豌豆组呈显著下降趋势，其中30%豌豆组的绒毛高度（472.7 ± 6.7 μm）显著低于10%豌豆组（523.1 ± 11.2 μm）。隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度比值在各处理间无显著差异。
**豌豆对盲肠SCFA、BCFA和氨产生的影响**：所有处理中乙酸浓度最高，其次为丁酸和丙酸；异丁酸、异戊酸和戊酸浓度均低于0.2 mg/g盲肠内容物。各处理组间SCFA和BCFA浓度无显著差异。氨浓度在各处理间差异不显著，但30%豌豆组较其他组出现明显的数值下降（从约0.35–0.37降至0.27 g/g盲肠内容物）。
**较高豌豆添加量改变盲肠内容物微生物组成**：α多样性（Chao1、Simpson和Shannon指数）在各处理间无显著差异。PERMANOVA分析显示日粮对β多样性有显著影响，但配对比较经FDR校正后未发现组间显著差异。属水平上，Lactobacillus为最优势属，其次为Faecalibacterium和Mediterraneibacter。LEfSe分析检测到少量判别性菌属：Romboutsia在30%豌豆组富集，Catellicoccus在对照组富集，10%和20%豌豆组未检测到判别菌属。
**增加豌豆添加量影响上消化道体外蛋白消化动力学**：所有日粮的蛋白质消化呈先升后平的趋势。经联合置信区间分析，对照组和10%豌豆组的体外蛋白消化动力学与20%和30%豌豆组显著不同。20%和30%豌豆组的速率常数k值较低，且更快达到较低的蛋白质消化平台值。从对照组向高豌豆日粮方向，体外蛋白消化率呈下降趋势，与体内观察结果一致。
**未消化组分组成的差异**：对照组未消化残渣的粗蛋白含量（11.31%）显著高于20%和30%豌豆组（8.47%–9.07%），但对照组残渣的总干重较低，提示对照组整体基质的消化/溶解更彻底。中性洗涤纤维（neutral detergent fiber, NDF）和酸性洗涤木质素（acid detergent lignin, ADL）含量随豌豆比例增加而显著下降，酸性洗涤纤维（acid detergent fiber, ADF）则显著增加，表明豌豆替代豆粕使残留细胞壁组分向更多纤维素、更少木质素的组成方向转变。
**豌豆添加提高体外产气动力学**：对未消化组分进行体外盲肠发酵时，对照组的总产气量（A）和半峰时间（B）均显著低于所有含豌豆日粮组；30%豌豆组的最大产气速率（Rmax）显著高于其余各组。
**豌豆组分驱动体外SCFA和BCFA产生**：发酵48小时后，对照组产生的乙酸、丙酸和丁酸量显著低于30%豌豆组（乙酸24.6 vs. 34.8–40.2 mg/mL底物，丙酸5.9 vs. 8.2–9.1 mg/mL底物，丁酸6.7 vs. 7.3–10.8 mg/mL底物）。SCFA生成量随豌豆添加比例增加呈明显上升趋势。同时，异丁酸和异戊酸等BCFA的生成量随豌豆添加比例增加呈显著下降趋势。
**含豌豆日粮体外氨产生量降低**：氨产生量随发酵时间增加而升高。发酵24小时后，对照组氨生成量的增幅逐渐高于豌豆组，最终（48小时）对照组氨生成量为6.1 mg/mL·g底物，而30%豌豆组为4.4 mg/mL·g底物，差异未达到统计学显著水平，但呈明显下降趋势。
**最高豌豆添加量影响体外微生物组成**：体外发酵12小时后，α多样性各指数在各处理间无显著差异，但随豌豆比例升高呈下降趋势。PERMANOVA显示日粮对β多样性有显著影响，配对比较表明对照组与30%豌豆组之间微生物组成差异显著。LEfSe分析显示，Faecalibacterium为30%豌豆组的判别菌属，Ruminococcaceae在对照组富集，Streptococcus为20%豌豆组的判别菌属，10%豌豆组未检测到判别菌属。
### 5. 讨论与结论总结
讨论部分指出，豌豆日粮中较低的蛋白质消化率和较差的生长性能可能源于生豌豆蛋白的结构特性、极轻度的加工（仅粉碎）、纤维效应和抗营养因子的综合作用，与秀珍豆粕（脱壳、浸油、热处理）相比形成了不同的原料基质效应。体内盲肠发酵代谢物未受显著影响，可能因为幼龄肉鸡盲肠微生物群尚处于早期发育阶段，且微生物发酵产物会被宿主吸收，使体内SCFA检测灵敏度有限。体外发酵中更显著的发酵反应是因为该系统不受宿主吸收干扰，且能在受控条件下更灵敏地检测到底物驱动的发酵模式变化。总体来看，体外模型与体内试验在蛋白质消化趋势上的一致性支持该模型作为筛选工具的有效性，但盲肠发酵阶段的预测能力仍需改进。研究结论部分表明：生豌豆可以部分替代幼龄肉鸡日粮中的豆粕，但存在添加限值；在消化能力仍在发育的早期阶段，较高的生豌豆添加量会降低生长性能、蛋白质消化率和回肠绒毛高度。所开发的体外模型在蛋白质消化方面与关键体内反应一致，并提供了时间依赖性的消化和发酵动力学见解；盲肠发酵反应在体外比体内更显著，提示该阶段仍需优化。该模型是首个将胃消化、小肠消化和盲肠发酵集成于单一体系中以模拟幼龄肉鸡全消化道的体外工具，有望用于肉鸡早期营养饲料原料和配方的快速、受控筛选，但在实际应用前需要进一步提高其对盲肠发酵的预测能力，尤其是接种物代表性和食糜组分的选取。
