禽类LEAP2基因可变多聚腺苷酸化转录本及其3′UTR稳定性特征解析

《Poultry Science》：Characterization of avian LEAP2 transcripts with alternative polyadenylation and their 3′UTR stability

摘要专业翻译 LEAP2是食欲与代谢的关键调控因子，然而其转录调控机制，尤其是不同摄食状态下由可变多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation, APA）产生的转录本异构体，在家禽中仍未得到充分表征。本研究结合组织表达谱分析、5′/3′?RACE和双荧光素酶报告基因实验，系统鉴定了禽类及小鼠中LEAP2的转录本异构体。组织表达谱显示，鸭LEAP2在肝脏、肾脏和小肠中高表达，而小鼠Leap2主要局限于肝脏和小肠。在所有受试禽类物种中均鉴定出两个由APA产生的LEAP2异构体，二者具有相同的编码序列但3′UTR长度不同（长、短变异体分别命名为l?3′UTR和s?3′UTR），小鼠中也存在同源异构体；禽类l?3′UTR序列在家禽物种间高度保守，但与小鼠直系同源序列存在显著差异。摄食状态分析揭示了禽类l-3′UTR-LEAP2丰度在餐后的变化。禁食?再喂食后，长3′UTR异构体在鸭中占主导地位（占总转录本的三分之二），而小鼠Leap2对摄食无响应。双荧光素酶实验证明3′UTR稳定性具有物种依赖性：s-3′UTR在鸡和鹌鹑中更稳定，而l-3′UTR在鸭中更稳定。机制上，RNA结合蛋白（RNA-binding protein, RBP）PUM2和ZFP36被验证可调节l?3′UTR稳定性，两个miRNA（gga?miR?2188?3p、gga?miR?190a?3p）被证实可靶向该3′UTR并在肝细胞中调控LEAP2表达。综上所述，本研究鉴定了家禽中保守的由APA产生的LEAP2 3′UTR异构体，其稳定性具有物种特异性，由RBPs和miRNAs共同调控，为深入研究LEAP2在禽类能量稳态中的作用机制奠定了基础。

论文解读

一、研究背景与科学问题

LEAP2最初作为抗菌肽在哺乳动物和家禽中被克隆鉴定，其抗菌活性长期是研究焦点。LEAP2可通过破坏细菌膜完整性或结合微生物DNA杀灭革兰氏阳性菌，并在多种感染和炎症条件下表达失调。2018年，Ge等人发现LEAP2作为生长激素促分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor, GHSR）的内源性配体，发挥食欲调控激素的功能，这一里程碑式发现将研究重点转向其代谢调控作用。LEAP2作为GHSR1a的内源性拮抗剂和反向激动剂，可抵消ghrelin介导的信号传导，参与肥胖、糖尿病、脂肪肝和肝脏炎症等代谢紊乱的调控。禽类研究同样证实LEAP2在鸡和鹌鹑的肝脏和肠道中高表达，其转录丰度与摄食状态紧密相关，禁食显著抑制LEAP2表达。

然而，以往关于LEAP2转录变异体的研究极为有限，已报道的研究几乎全部集中于内含子保留型可变剪接事件，而非由APA产生的3′UTR长度变异体。APA介导的3′UTR多样性是调控mRNA稳定性和营养响应性的核心转录后机制，但LEAP2在APA层面的转录调控，尤其是不同摄食状态下长、短异构体的表达动态及其调控机制，在家禽中仍是空白。研究人员前期在鹌鹑中发现了一个新型的摄食诱导的长3′UTR LEAP2异构体，但其功能、调控机制及跨物种保守性均未得到表征。

基于上述背景，研究人员提出假设：LEAP2的APA衍生长、短转录本异构体（l-LEAP2、s-LEAP2）在物种间保守存在，具有物种特异性的mRNA稳定性差异，并由RBPs和miRNAs等调控因子协同调节以介导摄食响应性。为验证这些假设，研究人员克隆了小鼠、鸡和鸭的LEAP2全长序列，系统表征了禽类3′UTR异构体的稳定性及其调控决定因素，为研究LEAP2转录调控奠定基础。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过系统的实验设计，得出以下核心结论：鸭LEAP2在肝脏、肾脏、十二指肠、空肠和回肠中高表达，小鼠Leap2主要局限于肝脏和小肠；所有受试禽类物种中均存在两个由APA产生的LEAP2异构体，具有相同CDS但不同3′UTR长度，小鼠中也存在同源异构体；禽类l-3′UTR序列高度保守，但与小鼠直系同源序列差异显著；禁食?再喂食后，鸭中l-3′UTR异构体占主导地位，而小鼠Leap2对摄食无响应；3′UTR稳定性具有物种依赖性，s-3′UTR在鸡和鹌鹑中更稳定，l-3′UTR在鸭中更稳定；RBPs PUM2和ZFP36以及miRNAs gga?miR?2188?3p和gga?miR?190a?3p共同调控l-3′UTR稳定性。这些发现揭示了家禽LEAP2异构体响应摄食波动的物种特异性调控模式，为理解禽类能量稳态的转录后调控机制奠定了基础。

三、关键技术与方法

研究人员采用多种关键技术开展研究。动物样本方面，选用10日龄北京鸭（Anas platyrhynchos）和37日龄昆明小鼠（Mus musculus），各12只雄性个体，随机分为自由采食组、禁食18小时组和禁食18小时后再喂食2小时组，每组4只；鸡样本来自 Arbor Acres（AA）肉鸡（Gallus gallus），包括15日龄和42日龄两个阶段。主要技术方法包括：5′/3′?RACE技术克隆LEAP2全长cDNA；RT?qPCR进行组织表达谱分析和不同摄食状态下异构体表达定量；双荧光素酶报告基因实验评估不同3′UTR的稳定性；RBPDB数据库预测RBP结合位点，Animal?APAdb数据库预测APA位点；miRNA mimics和inhibitors转染验证miRNA调控功能；原代鸡胚肝细胞（E14）和原代鸡胚肠上皮细胞（E19）作为细胞模型。

四、研究结果

不同物种LEAP2全长cDNA克隆。 通过RT?qPCR构建鸭和小鼠的LEAP2组织表达谱，确认鸭LEAP2在肝脏、肾脏、十二指肠、空肠和回肠中高表达，小鼠Leap2主要在肝脏和小肠中高表达。5′/3′?RACE结合Sanger测序确认所有受试物种均产生两个具有不同3′UTR长度的mRNA异构体。鸡和鸭的LEAP2全长序列已提交GenBank（登录号PZ836229–PZ836233），小鼠长转录本序列与GenBank现有条目（NM_153069.3）一致。RT?PCR进一步验证了长3′UTR转录本的存在。

不同能量状态下LEAP2异构体表达。 鸡的肝脏、十二指肠和空肠中，禁食组t-LEAP2和l-LEAP2表达较自由采食组显著降低，再喂食组无显著差异；回肠中各摄食组间无显著变化。鸭的肝脏、肾脏、十二指肠和空肠中禁食显著降低t-LEAP2和l-LEAP2表达，回肠中再喂食组与自由采食组和禁食组均有显著差异；禁食组和再喂食组中l-LEAP2占总转录本的2/3，自由采食组仅约30%。小鼠各组织中t-LEAP2和l-LEAP2在自由采食和禁食组间均无显著变化，仅肝脏在再喂食组有显著差异；l-LEAP2在所有摄食条件下均占主导地位，超过总转录本的90%。

禽类LEAP2异构体3′UTR差异稳定性。 构建携带各物种l-和s-3′UTR序列的pmir-GLO荧光素酶报告载体，在原代鸡胚肝细胞和肠上皮细胞中进行双荧光素酶实验。结果显示鸡3′UTR整体稳定性高于鸭和鹌鹑。物种内比较发现：鸡s-3′UTR比l-3′UTR更稳定，鹌鹑s-3′UTR比l-3′UTR更稳定，鸭s-3′UTR比l-3′UTR更稳定。肠上皮细胞中的稳定性模式与肝细胞一致，但鹌鹑s-3′UTR在肠细胞中与鸡s-3′UTR稳定性相当。

与LEAP2 3′UTR互作的RBPs筛选与功能验证。 RBP预测显示l-3′UTR上预测的RBP数量多于s-3′UTR。鸡s-3′UTR含有多个稳定性促进RBP（RBFOX1、SFRS9），结合位点位于3′末端附近；鹌鹑在对应位置仅有一个稳定性促进RBP（SFRS9），鹌鹑和鸭在s-3′UTR 3′末端附近均有稳定性抑制RBP结合位点而鸡无。禽类l-3′UTR特有延伸区域具有高UA含量（鸡78.95%、鹌鹑79.75%、鸭80.82%），预测到稳定性促进RBP（PABPC1、ELAVL2）和稳定性抑制RBP（PUM2、ZFP36）。RT-PCR确认候选RBPs在原代鸡胚肝细胞和肝脏组织中均有表达，而RBFOX1和ELAVL2在肠上皮细胞中未检出。肝细胞中双荧光素酶实验显示：s-3′UTR中PUM2突变显著升高荧光素酶活性，SFRS9突变显著升高活性，RBFOX1突变无显著效应；l-3′UTR中PUM2突变显著升高活性，ZFP36突变降低活性，PABPC1突变显著升高活性。肠上皮细胞中各RBP突变均未引起显著变化。

靶向LEAP2 3′UTR的miRNAs筛选。 miRNA结合位点预测显示鸡和鹌鹑l-3′UTR上的miRNA结合位点数量多于s-3′UTR（鸡：9 vs 4；鹌鹑：11 vs 5），鸭长、短3′UTR上miRNA位点数量相当（14 vs 10）。选择靶向鸡l-3′UTR的两个miRNAs（gga?miR?2188?3p和gga?miR?190a?3p）进行实验验证。在原代鸡胚肝细胞中过表达任一miRNA均显著抑制l-LEAP2和t-LEAP2转录本表达，而相应inhibitor处理则上调l-LEAP2和t-LEAP2转录本水平。

五、讨论与结论

讨论部分指出，鸭LEAP2组织表达模式与鹌鹑一致，表明LEAP2在禽类谱系中的组织表达模式具有保守性，而鸡肾脏中相对低表达可能与物种间肾脏生理适应性差异有关。APA产生的两个LEAP2转录本异构体在家禽和小鼠中均存在，这一现象在禽类和哺乳动物间保守，但需更多证据验证其在其他哺乳动物中的保守性。鸡s-LEAP2与NCBI参考序列基本一致，l-LEAP2为首次报道的新异构体；鸭两个克隆转录本的5′UTR均短于参考基因组注释，提示鸭LEAP2参考注释可能存在错误。禽类l-3′UTR序列高度保守（短UTR同源性97%、长UTR同源性98%），而小鼠UTR序列与禽类差异显著，表明哺乳动物与禽类LEAP2基因组序列在长期进化中已发生显著分化，但成熟肽编码序列高度保守。

摄食状态实验表明鸡、鸭和鹌鹑的t-LEAP2和l-LEAP2在肝脏和肠道等组织中随能量状态动态变化，而小鼠Leap2对摄食无显著响应，提示LEAP2对饮食信号的反应性存在物种间差异。3′UTR稳定性实验解释了不同禽类物种间异构体丰度的差异：鸭中l-3′UTR更稳定因而再喂食后积累更多，鸡和鹌鹑中s-3′UTR更稳定因而相对丰度更高。RBP功能验证结果部分与预测不一致，可能由于RBP结合依赖周围UA富集序列的调控作用。除RBPs外，miRNAs也是调控LEAP2 mRNA稳定性的重要因子。

研究结论：本研究鉴定出禽类和小鼠中两个保守的由APA产生的LEAP2异构体，二者3′UTR长度不同，主要在肝脏和肠道中表达并对摄食状态有响应；再喂食鸭中l-3′UTR异构体占总转录本的2/3；3′UTR依赖性转录本稳定性在家禽中呈现物种特异性模式——鸡和鹌鹑中s-3′UTR更稳定，鸭中l-3′UTR更稳定；RBPs和miRNAs共同调控LEAP2 3′UTR稳定性，但仍需鉴定其他调控因子。这些发现揭示了禽类LEAP2异构体响应摄食波动的物种特异性调控模式，可能与采食量和能量代谢相关，各异构体的精确生理功能有待进一步研究。