《Pathology - Research and Practice》：Formulation optimisation of an mRNA-lipid nanoparticle platform sustains in vivo production of the SARS-CoV-2-neutralizing nanobody VHH 72
编辑推荐：
•将DSPC提高至40 mol%，并使用300 mM柠檬酸盐，可提高mRNA在血清中的保留率。•40%PC-300mM配方提高了VHH 72-eGFP在HEK293T细胞中的表达。•优化后的配方使DiD和荧光素酶信号的衰减更加缓慢。•单次给药即可延长可检测到的循环VHH 72
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将DSPC提高至40 mol%，并使用300 mM柠檬酸盐，可提高mRNA在血清中的保留率。
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40%PC-300mM配方提高了VHH 72-eGFP在HEK293T细胞中的表达。
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优化后的配方使DiD和荧光素酶信号的衰减更加缓慢。
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单次给药即可延长可检测到的循环VHH 72和中和活性。
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预处理可降低小鼠血液和肺部中假病毒报告信号。
引言
中和单克隆抗体能够提供快速、直接的抗病毒活性，并已被广泛应用于SARS-CoV-2及其他病毒感染[1]。骆驼科动物还能产生仅重链抗体，其可变结构域（通常称为VHH或纳米抗体）在紧凑的结构中保留了抗原结合能力[2]。其较小的分子量有利于组织渗透[3]，但也可能导致肾脏快速清除和有限的全身暴露。VHH 72是一种针对β冠状病毒刺突蛋白分离的交叉反应性单域抗体，在适当格式下被证明能够干扰受体结合并中和SARS-CoV-2假病毒[4]、[5]、[6]。
延长纳米抗体暴露时间的策略包括Fc融合、白蛋白结合以及共投给予半衰期延长伴侣蛋白[7]、[8]。这些方法虽然有效，但会改变蛋白质产品本身。另一种替代方案是递送编码该抗体的核酸，使宿主细胞瞬时产生治疗性蛋白。核苷修饰mRNA已在体内针对HIV-1、基孔肯雅病毒、流感病毒、热河谷热病毒以及更近期的SARS-CoV-2和流感产生具有保护性或具有药理学相关性的抗体浓度[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。
脂质纳米颗粒是目前mRNA递送的主要非病毒平台。其性能取决于可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇、PEG-脂质以及配方条件。增加辅助脂质含量可改变LNP形态、血清稳定性、循环行为及蛋白表达[14]，而更广泛的配方分析强调了脂质比例和制造参数的重要性[15]。LNP形成过程中柠檬酸盐缓冲液的浓度也会影响颗粒特性及mRNA-LNP性能[16]。除mRNA药物外，基于纳米颗粒的递送系统也被用于miRNA疗法的研究，突显了载体设计在保护治疗性RNA和促进其递送至靶细胞方面的重要作用[17]。近期的一篇预印本研究进一步将酸性混合缓冲条件与液泡形成及改善的液态稳定性相关联[18]，但这些观察结果并未确立本配方中所起作用的机制。
不同的实验载荷在基于mRNA编码抗体的研究中回答不同的问题。荧光融合蛋白报告细胞或组织表达，荧光素酶报告一般的转基因表达动力学，而血清免疫测定和中和试验则为未标记的治疗性抗体提供直接证据。在评估基于mRNA编码纳米抗体的持久性时，区分这些读出指标至关重要。更广泛地说，近年来非病毒mRNA治疗工程的进展已凸显了表达持久性和递送效率是临床转化的重要挑战，尽管不同平台之间的细胞靶标和治疗应用可能存在显著差异[19]。
在本研究中，我们通过比较传统的10%PC-25mM配方与含40 mol% DSPC在25或300 mM柠檬酸盐条件下的配方，优化了VHH 72 mRNA-LNP平台。我们将治疗性VHH 72构型与用于荧光表达研究的VHH 72-eGFP报告基因以及用于测量体内表达动力学的相关性荧光素酶报告基因区分开来。本研究旨在确定配方变化是否能改善mRNA保护和表达，以及循环VHH 72活性的增加是否能转化为全身性系统模型和气道近端攻毒模型中假病毒相关报告信号的降低。因此，本研究的结论仅限于假病毒入侵和报告基因表达，而不涉及真正的SARS-CoV-2感染。
章节摘要
材料与动物
材料：编码纳米抗体VHH 72及纳米抗体VHH 72-eGFP基因序列的质粒购自Cloud-Clone Corp.（中国广州）。T7 High Yield RNA Transcription Kit、痘苗帽酶及mRNA Cap 2′-O-甲基转移酶购自Vazyme Biotech Co. Ltd.（中国南京）。SapI限制性内切酶由New England Biolabs提供（美国马萨诸塞州贝弗利市）。柠檬酸盐缓冲液（25 mM/300 mM，pH 4.0）购自北京莱根生物技术有限公司（北京，
VHH 72-mRNA的设计与鉴定
使用基于mRNA编码的抗体表达平台，我们构建了一个由T7启动子、5′ UTR、Kozak序列、VHH 72 ORF、3′ UTR及多聚(A)尾两侧的VHH 72序列（图1A），生产工作流程总结于图1B。质粒线性化在2000 bp和4000 bp标记之间产生一条单一带（图1C）。体外转录后经酶法加帽，加帽前后均可观察到一条约1200 nt的主要转录本（图1D）。
讨论
完整mRNA在含50% FBS培养基中保留率更高，以及体内DiD相关信号衰减更慢，两者均与颗粒结构上的配方依赖性差异一致，而非某种单一主导机制。增加辅助磷脂DSPC的摩尔分数预计会增加脂质双层的堆积密度和刚性，这将预测会减少脂质成分与血清蛋白之间的交换，从而
结论
将DSPC含量提高至40 mol%并在配方过程中使用300 mM柠檬酸盐，产生了一种mRNA-LNP，其相对于10%PC-25mM具有更好的mRNA保护和更强、更持久的报告基因表达。优化后的配方显示出DiD相关荧光的衰减更慢、荧光素酶和VHH 72-eGFP报告基因输出更高，以及循环VHH 72浓度和中和活性更为持久。在腹腔内和气管内假病毒攻毒模型中，40%PC-300mM产生了
伦理声明
本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经北京药理学与毒理学研究所批准。（批准号：IACUC-DWZX-2023-539）
伦理批准与知情同意
所有实验程序均按照北京药理学与毒理学研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针进行（批准编号：IACUC-DWZX-2023-539）。
资助
本研究由中国国家自然科学基金（编号：82473861、32371440）和国家重点研发计划（编号：2023YFC2605000）资助。
CRediT作者贡献声明
董雨涵：原稿撰写。李萌：项目管理。刘楠：资金获取。李琪琪：数据整理。欧阳艳洁：研究方法。郑爱平：论文审阅与编辑，资金获取。王西伟：监督指导。邢好南：项目管理，数据整理。
利益冲突声明
作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。
董雨涵|李琪琪|欧阳艳洁|李萌|刘楠|王西伟|邢好南|郑爱平
